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低密度脂蛋白膽*醇（LDL-C）含量檢測(cè)試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作,。

貨號(hào)：BC5330

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

提取液一：自備異丙醇，大約需要60mL,，常溫保存,；試劑盒內(nèi)提供一個(gè)30mL棕色空瓶，僅做分裝使用,，請(qǐng)自行標(biāo)注試劑名稱,。

試劑一C：液體置于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中。

試劑一的配制：根據(jù)樣本量將試劑一A：試劑一B：試劑一C按2.25 mL：20 μL：3 μL（2.273mL,，約3T）的比例進(jìn)行配制,，現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完,。

標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg膽*醇,，臨用前加入517 μL提取液，振蕩溶解,，即為50 μmol/mL的膽*醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,，2-8℃可保存4周。

產(chǎn)品說明：

低密度脂蛋白是血清脂蛋白中膽*醇含量最高的一種脂蛋白,，其顆粒較小,，主要作用是將肝臟組織的膽*醇經(jīng)過血液轉(zhuǎn)運(yùn)至其他組織，促進(jìn)組織細(xì)胞中膽*醇的積累,。眾多流行病學(xué)研究表明,，血清低密度脂蛋白膽*醇（Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）水平與動(dòng)脈粥樣硬化（AS）,、冠心?。?/span>GHD）呈正相關(guān),，對(duì)于臨床診斷動(dòng)脈粥硬化、冠心病,、高血壓等疾病有重要參考價(jià)值,。

使用選擇性表面活性劑，特異性解離出CM,、VLDL,、HDL中的膽*醇，而不作用于LDL,，解離出的膽*醇與膽*醇酯酶(CHER)和膽*醇氧化酶(CHOD)反應(yīng)產(chǎn)生H₂O₂,，在缺乏顯色劑的情況下被消耗掉而不顯色；未被分解的LDL在另一特異性表面活性劑的作用下解離,，利用酯酶催化膽*醇酯水解生成游離膽*醇（FC）和游離脂肪酸（FFA）,，從而把膽*醇酯轉(zhuǎn)化為FC；進(jìn)一步利用膽*醇氧化酶催化FC氧化,，生成4-膽甾烯酮和H₂O₂,；最后利用過氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安*林和苯胺類似物，生成紫色化合物,，其在546nm有特征吸收峰,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者

增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、天平、低溫離心機(jī),、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀,、可調(diào)式移液槍,、冰、蒸餾水,、異丙醇（AR）,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g,，4℃離心10min,，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W,，超聲2秒,，間隔3秒，總時(shí)間3min）,；然后10000g,，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè),。

3. 血清（漿）等液體樣本：直接測(cè)定,。若有沉淀請(qǐng)離心后取上清待測(cè)。

二,、測(cè)定步驟

1. 可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至546nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 根據(jù)樣本量取試劑一,、試劑二37℃預(yù)熱10min。

3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將50μmol/mL膽*醇標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取液進(jìn)行稀釋得到2.5,、1.25,、0.625、0.3125,、0.15625,、0.078125、0.0390625μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,。

4. 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：（實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)溶液）

5. 在1mL玻璃比色皿按下表步驟加樣：

充分混勻，37℃靜置5min,，測(cè)定546nm處吸光值A2,，分別記為A2測(cè)定、A2標(biāo)準(zhǔn),、A2空白,，計(jì)算?A測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2空白-A1空白），?A標(biāo)準(zhǔn)=（A2標(biāo)準(zhǔn)-A1標(biāo)準(zhǔn)）-（A2空白-A1空白）,?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)曲線只需測(cè)1-2次。

注：若樣本為血清（漿）等液體樣本，則需要增加‘血清（漿）空白管’-即將空白管中的提取液（異丙醇）更換為蒸餾水進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A血清（漿）空白,，標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定及ΔA標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算不變。

三,、低密度脂蛋白膽*醇含量計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x,，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)）,，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（y,，ΔA測(cè)定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x,，μmol/mL）。

2. LDL-C含量的計(jì)算：

（1）按血清（漿）等液體體積計(jì)算：

LDL-C含量（μmol/dL）=x×100

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

LDL-C含量（μmol/mg prot）=x×V樣本÷（Cpr×V樣本）=x÷Cpr

（3）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

LDL-C含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×V樣本÷（W×V樣本÷V提?。?/span>=x÷W

（4）按細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：

LDL-C含量(μmol /10⁴ cell)=x×V樣本÷（N×V樣本÷V提?。?/span>= x÷N

100：單位換算系數(shù)，1dL=100mL,；V樣本：加入樣本上清的體積,，0.02mL；V提?。杭尤胩崛∫旱捏w積,，1mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，以萬(wàn)計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1. 如果測(cè)定吸光值超出線性范圍吸光值,，可以增加樣本量或者用提取液稀釋樣本上清（液體樣本用蒸餾水稀釋）后再進(jìn)行測(cè)定,。注意同步修改計(jì)算公式。

2. 提取液中含有使蛋白變性的成分,，故按蛋白濃度計(jì)算時(shí)需要重新提取蛋白進(jìn)行測(cè)定,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取20μL人血清樣本,，按照測(cè)定步驟操作,，使用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2空白-A1空白）=（0.728-0.028）-（0.014-0.013）=0.699，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1723x-0.0178,，計(jì)算x=4.160,，按血清（漿）等液體體積計(jì)算：

LDL-C含量（μmol/dL）=x×100=4.160×100=416.019 μmol/dL。

2、 取0.11g小鼠肝臟樣本,，加入1mL提取液,，冰浴勻漿，離心后取上清按照測(cè)定步驟操作,，使用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2空白-A1空白）=（0.264-0.028）-（0.014-0.013）=0.235,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1723x-0.0178，計(jì)算x=1.467,，按樣本質(zhì)量計(jì)算：

LDL-C含量（μmol/g 質(zhì)量）=x÷W=1.467÷0.11=13.338 μmol/g 質(zhì)量,。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hiroyuki S, Tetsumi I, Yoshinori U, et al. Homogeneous assay for measuring low-density lipoprotein cholesterol in serum with triblock copolymer and α-cyclodextrin sulfate[J]. Clinical Chemistry, 1998, 44(3):522-531.

[2] Sakaue T, Hirano T, Yoshino G, et al. Reactions of direct LDL-cholesterol assays with pure LDL fraction and IDL: comparison of three homogeneous methods [J]. Clinica Chimica Acta, 2000, 295(1-2):97-106.

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