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檸檬酸合酶（CS）活
性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號: BC1060
規(guī)格: 25T/12S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 試劑五：臨用前加入500 μL雙蒸水,，用不完的試劑仍-20℃保存；

2. 試劑六：臨用前加入1.5 mL雙蒸水,，用不完的試劑仍-20℃保存,。

產(chǎn)品說明：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,，是三羧酸循環(huán)第一個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一,。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔*A,，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸光值,。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計,、低溫離心機(jī),、水浴鍋、研缽/勻漿器,、可調(diào)節(jié)移液器,、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
操作步驟：
一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,，加入1mL提取液和10μL 試劑二,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2. 將勻漿液600g,，4℃離心5min,。將上清液移至另一離心管中，11000g,，4℃離心10min,。

3. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的CS,。

4. 在沉淀中加入200μL試劑一和2μL 試劑二,，反復(fù)吹打充分混勻，用于CS測定,，并用于蛋白濃度測定,。

二、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至412nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中預(yù)熱10min左右（保證無沉淀）,。

3. 操作表：在1mL玻璃比色皿中分別加入

將上述試劑按順序加入1mL玻璃比色皿中,，加試劑六的同時開始計時，記錄412nm波長下10秒時的初始吸光度A1,，之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2分鐘,；迅速取出比色皿并擦干，412nm下記錄2分10秒時的吸光度A2,，并計算測定管的ΔA1=A2-A1,，對照管的ΔA1’=A2’-A1’，ΔA=ΔA1-ΔA1’。
三,、CS活性計算
按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：37℃或25℃下每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活力單位,。
CS（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（Cpr×V樣本）÷T=1050×ΔA÷Cpr
ε：TNB的消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm),；V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣本：加入的樣本體積,，0.035mL,；T：反應(yīng)時間,，2min,；Cpr：樣本的蛋白濃度，mg/mL,。
注意事項(xiàng)：
1,、測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活,。
2,、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水,，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中,。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3,、最好兩個人同時做此實(shí)驗(yàn),，一個人比色，一個人計時,，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
4、推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活,，若用樣本質(zhì)量計算,，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活,。
5,、附：使用樣本鮮重計算公式
單位的定義：37℃或25℃下每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS上清（U/g 質(zhì)量）=ΔA上清÷ε÷d×V反總÷（W×V樣本÷V提?。?span style="font-family: Times New Roman, Times, serif">÷T=1061×ΔA上清÷W
CS沉淀（U/g 質(zhì)量）=ΔA沉淀÷ε÷d×V反總÷（W×V樣本÷V樣總）÷T=212×ΔA沉淀÷W
CS（U/g 質(zhì)量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
ΔA上清：上清測定值,；ΔA沉淀：沉淀測定值；ε：TNB的消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm),；V反總：反應(yīng)體系總體積,，1mL；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣本：加入的樣本體積，0.035mL,；V提?。禾崛∫后w積，1.01mL,；V樣總：溶解沉淀的總體積,，0.202mL；T：反應(yīng)時間,，2min,；W：樣本質(zhì)量，g,。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
取0.1g小鼠心臟樣本加入1mL提取液和10μL試劑二進(jìn)行勻漿研磨,，取上清后再離心，取上清,，取沉淀后加入200μL試劑一和2μL試劑二,，之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測吸光度后計算上清中：ΔA1= A2-A1=1.213-0.7=0.513,，ΔA1’=A2’-A1’=0,，ΔA上清=ΔA1-ΔA1’=0.513；沉淀中：ΔA 1=A2-A1=0.447-0.133=0.314,，ΔA1’=A2’-A1’=0,，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.314，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
CS（U/g 質(zhì)量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
= 1061×0.513÷0.1+212×0.314÷0.1=6108.7U/g 質(zhì)量,。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Zhang J, Lv J, Xie J, et al. Nitrogen Source Affects the Composition of Metabolites in Pepper (Capsicum annuum L.) and Regulates the Synthesis of Capsaicinoids through the GOGAT–GS Pathway[J]. Foods, 2020, 9(2): 150.

參考文獻(xiàn)：
[1]  Agostinho F R, Réus G Z, Stringari R B, et al. Treatment with olanzapine, fluoxetine and olanzapine/fluoxetine alters citrate synthase activity in rat brain[J]. Neuroscience letters, 2011, 487(3): 278-281.
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0310/BC0315 輔酶Ⅰ NAD（H）含量檢測試劑盒
BC1030/BC1035 NAD激酶（NADK）活性檢測試劑盒
BC0630/BC0635 NADH氧化酶（NOX）活性檢測試劑盒
BC1130/BC1135 NAD-蘋果酸酶（NAD-ME）活性檢測試劑盒

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