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一般培養(yǎng)——維持ES細胞處于未分化狀態(tài)
ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì),。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次,，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前,，通過預先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時,，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開,。將細胞全程置于37℃,，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。


培養(yǎng)基
ES:
配制一20×不含DMEM,，HS,，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml FALCON管中,，（稀釋為2×,，每管42ml），貯存在-20℃,。通過將21ml該溶液,，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾,。貯存于4℃,。 注：一瓶DMEM是500ml。

貯存液
DMEM（高糖）
馬血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST
ESGRO

復蘇細胞
細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成,，結(jié)晶的形成會損害細胞,。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性,，快速的進行細胞復蘇是很重要的,。

步驟：
1．從液氮中取出一管細胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解）,；
3．將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中,；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
5．離心3分鐘,；
6．棄上清,，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，少吹打10次,；
7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿,；
8．孵育。

凍存細胞
凍存液
90％HS和10％二甲基亞砜

步驟：
1．1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi),；
2．用細胞刮刀收集細胞,；
3．將細胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10cm的培養(yǎng)皿用2ml,，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml,。）
5．分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml,；
6．置－80℃過夜,，第二天移入液氮。

明膠包被
準備500ml 0.1％明膠溶液
1．將0.5g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）,。
2．好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.2μm濾膜過濾,，貯存在4℃,。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15cm培養(yǎng)皿加2ml，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml,，溶液的量并不重要,，只要能*覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）,；
2．置室溫30分鐘,；
3．去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置,，好將板子平方,，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。