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細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342 /PI 雙染試劑盒
一,、原理
熒光染料 Hoechst 33342 能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜,，使其染上低藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng),，因此
進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342 比正常細(xì)胞的多,，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，此外,，凋亡細(xì)胞的染色
體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA 結(jié)合,，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到
損傷不能有效地將Hoechst 33342 排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。而
PI 染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中,，即活細(xì)胞對PI 染料拒染,，而壞死細(xì)胞由于膜完整
性在早期即已破損,，可被PI 染料染色。根據(jù)這些特性,，用Hoechst 33342 結(jié)合PI 染料對凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色,，
就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來,。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,，這三群
細(xì)胞表現(xiàn)分別為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色（Hoechst
33342++/PI+）,，壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）,。
二、試劑盒組份
組份 100 assays
Heochst 33342 染液1.0mL
Propidium Iodide （PI） 500 ul
10×PBS 10 mL
三,、操作步驟
1. 懸浮生長的細(xì)胞離心收集,，固定培養(yǎng)的細(xì)胞消化收集后，將105~106 個細(xì)胞懸浮于1ml 培養(yǎng)基中,，再加入
10ul Heochst 33342 染液,，混勻，370C 孵育5-15 min,；
2. 細(xì)胞于 40C 500 ~ 1000r/min 離心5min 棄去上清液,；
3. 加入1.0ml PBS 懸浮細(xì)胞，加入5 ul PI 染液,，避光混勻,；
4 流式細(xì)胞儀分析或熒光顯微鏡觀察：Heochst 33342 用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長為352nm,，發(fā)射波長
為400 ~ 500nm,，產(chǎn)生蘭色熒光；PI 用氬離子激光激發(fā)熒光,，激發(fā)光波波長為488nm,，發(fā)射光波波長大于630nm，
產(chǎn)生紅色熒光,。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖,。結(jié)果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖上,，
結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光,，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光,。
四,、注意事項
1. 在紅色熒光對蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡,，可能是凋亡細(xì)胞的DNA
進(jìn)一步降解的緣故,。
2. 用Heochst 33342 染料與細(xì)胞孵育的時間不宜過長,，一般控制在20min 之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst
33342 的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移,，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,，從而影響結(jié)果的判斷。
3 Propidium Iodide （PI）有毒,，操作時要戴手套
五,、儲存 置于 40C 避光，可保存一年,。