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細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342 /PI 雙染試劑盒

閱讀:9999      發(fā)布時(shí)間:2010-1-4
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細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342 /PI 雙染試劑盒
一,、原理
熒光染料 Hoechst 33342 能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜,,使其染上低藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng),,因此
進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342 比正常細(xì)胞的多,,熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高,此外,,凋亡細(xì)胞的染色
體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA 結(jié)合,,并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到
損傷不能有效地將Hoechst 33342 排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。而
PI 染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中,,即活細(xì)胞對(duì)PI 染料拒染,,而壞死細(xì)胞由于膜完整
性在早期即已破損,可被PI 染料染色,。根據(jù)這些特性,,用Hoechst 33342 結(jié)合PI 染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色,
就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞,、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來,。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,這三群
細(xì)胞表現(xiàn)分別為:正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),,凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色(Hoechst
33342++/PI+),,壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++)。
二,、試劑盒組份
組份 100 assays
Heochst 33342 染液1.0mL
Propidium Iodide (PI) 500 ul
10×PBS 10 mL
三,、操作步驟
1. 懸浮生長的細(xì)胞離心收集,固定培養(yǎng)的細(xì)胞消化收集后,,將105~106 個(gè)細(xì)胞懸浮于1ml 培養(yǎng)基中,,再加入
10ul Heochst 33342 染液,混勻,,370C 孵育5-15 min,;
2. 細(xì)胞于 40C 500 ~ 1000r/min 離心5min 棄去上清液;
3. 加入1.0ml PBS 懸浮細(xì)胞,,加入5 ul PI 染液,,避光混勻;
4 流式細(xì)胞儀分析或熒光顯微鏡觀察:Heochst 33342 用氪激光激發(fā)的紫外光,,激發(fā)波長為352nm,,發(fā)射波長
為400 ~ 500nm,產(chǎn)生蘭色熒光;PI 用氬離子激光激發(fā)熒光,,激發(fā)光波波長為488nm,,發(fā)射光波波長大于630nm,
產(chǎn)生紅色熒光,。分析蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖,。結(jié)果判斷:在蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上,
結(jié)果為:正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光,,凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光,,壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。
四,、注意事項(xiàng)
1. 在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上,,還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡,可能是凋亡細(xì)胞的DNA
進(jìn)一步降解的緣故,。
2. 用Heochst 33342 染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過長,,一般控制在20min 之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst
33342 的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移,,導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,,從而影響結(jié)果的判斷。
3 Propidium Iodide (PI)有毒,,操作時(shí)要戴手套
五,、儲(chǔ)存 置于 40C 避光,可保存一年,。

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