膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上,。若用保溫箱,，ELISA
板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底
墊濕的紗布,，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱
中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此,。無論是
水浴還是濕盒溫育,，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅
速平衡,。室溫溫育的反應(yīng),，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍
內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要
求控制溫育,。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可,。應(yīng)
注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成
敗,。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目
的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物
質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚
苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種
非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中,，洗滌
是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視,，操作者應(yīng)嚴(yán)格按
要求洗滌,，不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外,，手工操作
一般用浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液,；b.用洗滌液過洗一遍（將
洗滌液注滿板孔后，即甩去）,；c.浸泡,，即將洗滌液注滿板孔，放置
1-2分鐘,，間歇搖動(dòng),，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體,。
吸干應(yīng)*,，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾
或吸水紙上拍干,；e.重復(fù)操作c和d,，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在
間接法中如本底較高,，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時(shí)間,。
6 顯色和比色
（1） 顯色
顯色是ELISA中的后一步溫育反應(yīng),，此時(shí)酶催化無色的底物生成
有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素,。在一定時(shí)間
內(nèi),，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng),。適
當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行,。在定量測(cè)定中，加入底物后的反
應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行,，
時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的
顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時(shí)間,，及時(shí)判斷,。
OPD底物顯色一般在室溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再
延長反應(yīng)時(shí)間,，可使本底值增高,。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，
顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行,，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng),。OPD
產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色,。
TMB受光照的影響不大,，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)邊觀
察結(jié)果,。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)
果。TMB經(jīng)HRP作用后,，約40分鐘顯色達(dá),，隨即逐漸減弱，
至2小時(shí)后即可*消退至無色,。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和
十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止,。這類終止劑尚
能使藍(lán)色維持較長時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪,，是目視判斷的良好終止
劑。此外,，各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色,，此時(shí)可用特定
的波長（450nm）測(cè)讀吸光值。
（2） 比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,，然后將板正確放
入酶標(biāo)比色儀的比色架中,。以軟板為載體的試驗(yàn),，需先將板置于標(biāo)
準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色,。好在加底物液顯色前,，先將軟
板邊緣剪凈，這樣,，此板就可*平妥坐入座架中,。
比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液
的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔）,，以記
錄本次試驗(yàn)的試劑狀況,。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各
孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,，然后進(jìn)行計(jì)算,。
比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD）,，現(xiàn)按規(guī)定用
吸光度（absorbence,，A），兩者含義相同,。通常的表示方法是,，將吸
收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm,，表示方
法為"A492nm"或"OD492nm",。
（3） 酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光
度計(jì),。針對(duì)固相載體形式的不同,，各有特制的適用于板、珠和小試
管的設(shè)計(jì),。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀,。酶標(biāo)儀的主要性能指
標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性,、重復(fù)性,、度和可測(cè)范圍、
線性等等,。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可到0.001,，準(zhǔn)確性為±
1%，重復(fù)性達(dá)0.5%,。舉例說,，若某孔測(cè)得的A值為1.083，則該孔
相對(duì)于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.083±0.01（1.073~1.093），重復(fù)測(cè)定
數(shù)次,，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.078~1.088）在之間,。酶標(biāo)儀的可
測(cè)范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.000~2.000,，
新型號(hào)的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá)2.900,，甚至更高。超出可測(cè)上限的A
值常以"*"或"over"或其它符號(hào)表示,。應(yīng)注意可測(cè)范圍與線性范圍的
不同,，線性范圍常小于可測(cè)范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍為
0.000~2.900,，而其線性范圍僅0.000~2.000,，這在定量ELISA中制
作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下,，操
作時(shí)室溫宜在15~30℃,，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果
更穩(wěn)定,。測(cè)讀A值時(shí),，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm
波長,。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測(cè)讀,，即每孔先后測(cè)讀兩次，*
次在適波長（W1）,，第二次在不敏感波長（W2）,，兩次測(cè)定間不移動(dòng)
ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1,，630nm為W2,，終測(cè)
得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測(cè)讀可減少由容器上的劃
痕或指印等造成的光干擾,。各種酶標(biāo)儀性能有所不同,，使用中應(yīng)詳
細(xì)閱讀說明書。
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