膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上,。若用保溫箱,，ELISA
板應放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底
墊濕的紗布,，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱
中預溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時候更應如此,。無論是
水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅
速平衡,。室溫溫育的反應,，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍
內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時可根據(jù)說明書的要
求控制溫育,。室溫溫育時,，ELISA板只要平置于操作臺上即可,。應
注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟,，但卻也決定著實驗的成
敗,。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目
的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物
質(zhì),，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚
苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種
非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌
是主要的關(guān)鍵技術(shù),，應引起操作者的高度重視,，操作者應嚴格按
要求洗滌，不得馬虎,。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外,，手工操作
一般用浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將
洗滌液注滿板孔后,，即甩去）,；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔,，放置
1-2分鐘,，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短,；d.吸干孔內(nèi)液體,。
吸干應*，可用水泵或真空泵抽吸,，也可甩去液體后在清潔毛巾
或吸水紙上拍干,；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）,。在
間接法中如本底較高,，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。
6 顯色和比色
（1） 顯色
顯色是ELISA中的后一步溫育反應,，此時酶催化無色的底物生成
有色的產(chǎn)物,。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素,。在一定時間
內(nèi)，陰性孔可保持無色,，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強,。適
當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,，加入底物后的反
應溫度和時間應按規(guī)定力求準確,。定性測定的顯色可在室溫進行，
時間一般不需要嚴格控制,，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的
顯色情況適當縮短或延長反應時間,，及時判斷。
OPD底物顯色一般在室溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,，再
延長反應時間,，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,，
顯色反應應避光進行,，顯色反應結(jié)束時加入終止液終止反應。OPD
產(chǎn)物用硫酸終止后,，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色,。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上,，邊反應邊觀
察結(jié)果,。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結(jié)
果,。TMB經(jīng)HRP作用后,，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱,，
至2小時后即可*消退至無色,。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和
十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止,。這類終止劑尚
能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪,，是目視判斷的良好終止
劑。此外,，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色,，此時可用特定
的波長（450nm）測讀吸光值。
（2） 比色
比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,，然后將板正確放
入酶標比色儀的比色架中,。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標
準96孔的座架中，才可進行比色,。好在加底物液顯色前,，先將軟
板邊緣剪凈，這樣,，此板就可*平妥坐入座架中,。
比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液
的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔）,，以記
錄本次試驗的試劑狀況,。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各
孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,，然后進行計算,。
比色結(jié)果的表達以往通用光密度（oplical density,，OD）,，現(xiàn)按規(guī)定用
吸光度（absorbence，A）,，兩者含義相同,。通常的表示方法是，將吸
收波長寫于A字母的右下角,，如OPD的吸收波長為492nm,，表示方
法為"A492nm"或"OD492nm"。
（3） 酶標比色儀
酶標比色儀簡稱酶標儀,，通常指于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光
度計,。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板,、珠和小試
管的設計,。許多試劑公司配套供應酶標儀。酶標儀的主要性能指
標有：測讀速度,、讀數(shù)的準確性,、重復性、度和可測范圍,、
線性等等,。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可到0.001，準確性為±
1%,，重復性達0.5%,。舉例說，若某孔測得的A值為1.083,，則該孔
相對于空氣的真實A值應為1.083±0.01（1.073~1.093）,，重復測定
數(shù)次，其A值均應1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標儀的可
測范圍視各酶標儀的性能而不同,。普通的酶標儀在0.000~2.000,，
新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高,。超出可測上限的A
值常以"*"或"over"或其它符號表示,。應注意可測范圍與線性范圍的
不同，線性范圍常小于可測范圍,，比如某一酶標儀的可測范圍為
0.000~2.900,，而其線性范圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制
作標準曲線時應予注意,。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下,，操
作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30分鐘,，測讀結(jié)果
更穩(wěn)定,。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,，如OPD用492nm
波長,。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次,，*
次在適波長（W1）,，第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動
ELISA板的位置,。例如OPD用492nm為W1,，630nm為W2，終測
得的A值為兩者之差（W1-W2）,。雙波長式測讀可減少由容器上的劃
痕或指印等造成的光干擾,。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳
細閱讀說明書,。
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