人β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)液體中β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往包被單抗的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗Aβ1-40抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的Aβ1-40呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 

標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為300 pg/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml,，150 pg/ml ,，75 pg/ml，37.5 pg/ml,，18.8 pg/ml,，9.4 pg/ml，4.7 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制150 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 300 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。

• 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
• 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
• 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
• 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
• 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
• 底物溶液：1×10ml/瓶,。
• 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
• 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標(biāo)本的采集及保存 

1.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.  血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,，如需長期保存，請(qǐng)置-20℃密封保存,，但也不應(yīng)超過3個(gè)月,；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,；高血脂的標(biāo)本不需進(jìn)行特殊處理,，可直接檢測。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?/span>試劑或樣品稀釋時(shí),，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時(shí),，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

• 加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘,。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

• 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。
• 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
• 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃,，60分鐘。
• 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
• 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。
• 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
• 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

注：

• 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔）,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。
• 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑,。
• 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，洗板拍干后請(qǐng)立即加入后步試劑,，應(yīng)避免微孔干燥掉。
• 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。
• 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用,。
• 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。
• 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
• 建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水

紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需

要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人Aβ1-40,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。

注意事項(xiàng)

1. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

3. 請(qǐng)每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。

4. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí),，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

6. 底物請(qǐng)避光保存,。

檢測范圍：

4.7 pg/ml -300 pg/ml

zui低檢測限：2.4 pg/ml

說明

• 在儲(chǔ)存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染,，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果,。
• 小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果,。
• 試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí),，僅適用于部分試劑，具體見標(biāo)簽）,；2-8℃（頻繁使用時(shí)）,。
• 有效期：6個(gè)月
• 濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。
• 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。
• 中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處,，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn),。
• 所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。