人β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關液體中β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)含量,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被單抗的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗Aβ1-40抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Aβ1-40呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 

標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋300 pg/ml,，150 pg/ml ,，75 pg/ml,，37.5 pg/ml，18.8 pg/ml,，9.4 pg/ml，4.7 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制150 pg/ml標準品：取0.5ml 300 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

• 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
• 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
• 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
• 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。
• 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
• 底物溶液：1×10ml/瓶。
• 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
• 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存 

1.  細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標本保存于-20℃,，且應避免反復凍融。

2.  血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存，但應避免反復凍融,。

3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融,。

注：以上標本置4℃保存應小于1周，如需長期保存,，請置-20℃密封保存,，但也不應超過3個月；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測,。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?/span>試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

• 加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

• 棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘。
• 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
• 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃，60分鐘,。
• 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
• 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。
• 依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。
• 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測,。

注：

• 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔）,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。
• 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫,。使用后立即冷藏保存試劑,。
• 洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標板加上蓋或覆膜,，洗板拍干后請立即加入后步試劑，應避免微孔干燥掉,。
• 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值。
• 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍的底物液不能使用,。
• 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
• 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
• 建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要,，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人Aβ1-40，且與其它相關蛋白無交叉反應,。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

3. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔,。

4. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5. 在配制標準品,、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制，不能混淆,。

6. 底物請避光保存,。

檢測范圍：

4.7 pg/ml -300 pg/ml

zui低檢測限：2.4 pg/ml

說明

• 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
• 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本 / 標準品,，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的 “預孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果,。
• 試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時，僅適用于部分試劑,，具體見標簽）,；2-8℃（頻繁使用時）。
• 有效期：6個月
• 濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
• 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
• 中,、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準。
• 所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。