人前鐵調(diào)素(Pro-Hepcidin)ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中前鐵調(diào)素（Pro-Hepcidin)含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的前鐵調(diào)素抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的前鐵調(diào)素抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物(TMB)顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的前鐵調(diào)素呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（值），計(jì)算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1,、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶,，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘,，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為20 ng/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）,，分別配制成20 ng/ml,，10 ng/ml，5 ng/ml,，2.5 ng/ml,，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml,，0.312 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制10 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）20 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類(lèi)推。

3,、 樣品稀釋液：1×20ml,。

4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml,。

5,、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。

6,、 檢測(cè)溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測(cè)溶液A / 990檢測(cè)稀釋液A）,，充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100/孔）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制  0.1-0.2ml,。

7、 檢測(cè)溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測(cè)稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。

8,、 底物溶液：1×10ml/瓶,。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H₂SO₄）,。

11,、覆膜：5張

12、使用說(shuō)明書(shū)：1份

自備物品

1,、 酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

2,、 微量加液器及吸頭，EP管

3,、 蒸餾水或去離子水,，濾紙

標(biāo)本的采集及保存

1、 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4過(guò)一夜后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20或-80保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000g離心15分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨?/span>置于-20或-80保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3、 其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20或-80保    存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存,，4保存應(yīng)小于1周,，-20不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月,；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫,，試劑不能直接在37溶解；試劑或樣品配制時(shí),，均需充分混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)觀(guān)測(cè)樣品含量,，如樣品濃度過(guò)高時(shí),，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

1,、 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液 100 ,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100,，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37溫育2小時(shí),。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效

性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2,、 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100（臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜,，37溫育1小時(shí),。

3、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘，大約400/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

4、 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（臨用前配制）100,，加上覆膜,，37溫育1小時(shí)。

5,、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，方法同步驟3,。

6、 每孔加底物溶液90,，酶標(biāo)板加上覆膜37避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘,，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí),，即可終止）,。

7、 每孔加終止溶液50,，終止反應(yīng),，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物    液的加入順序相同,。

8,、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（值）。

注：

1,、 試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭,，避免交叉污染。

2,、 加樣：加樣或加試劑時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間,，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

3,、 溫育：為防止樣品蒸發(fā),，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度,。

4,、 洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5,、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液,、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請(qǐng) 配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí),，一次不要小于10）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀  釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液,、檢測(cè)溶液B工作液。

6,、 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀(guān)察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘），如顏色較深,，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7,、 底物：底物請(qǐng)避光保存,，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

洗板方法

1,、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次,。

2,、 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人前鐵調(diào)素,，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點(diǎn)圖）,，如設(shè)置復(fù)孔,，則 應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線(xiàn)軟件進(jìn)行分析,，如 curve expert 1.3,，根據(jù)樣品值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度,，乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。

檢測(cè)范圍：0.312 ng/ml - 20 ng/ml,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)請(qǐng)取用以下濃度值：20 ng/ml，10 ng/ml,，5 ng/ml,，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml,，0.625 ng/ml,，0.312 ng/ml。

zui低檢測(cè)限：0.078 ng/mL

說(shuō)明

•  由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析,，

    本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn),。

•  zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),，請(qǐng)務(wù)必

準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份,。

3、 在儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的   污染,，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

4,、 試劑盒保存：請(qǐng)收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A和檢測(cè)溶液B保存于-20，其余試劑短期保存請(qǐng)置于4,，長(zhǎng)期保存則置于-20,。開(kāi)封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于-20，避免潮濕,。

5,、 濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。

6,、 剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

7,、 有效期：6個(gè)月,。

8、 本操作說(shuō)明適用于48T試劑盒,，但48T試劑盒所有試劑減半,。