人E選擇素（E-Selectin）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

預期應用

ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關液體中E-選擇素（E-Selectin）含量,。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中E-Selectin水平。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入E-Selectin抗原、生物素化的抗人E-Selectin抗體,、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的E-Selectin呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 

標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10,000 pg/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋10,000 pg/ml，5,000 pg/ml,，2,500 pg/ml,，1,250 pg/ml，625 pg/ml,，312.5 pg/ml,，156 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml,，臨用前15分鐘內配制,。

如配制5,000 pg/ml標準品：取0.5ml 10,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

• 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
• 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
• 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
• 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制,。
• 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
• 底物溶液：1×10ml/瓶,。
• 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
• 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標本的采集及保存 

1.  細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃,，且應避免反復凍融,。

2.  血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融,。

3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?/span>試劑或樣品稀釋時,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線,。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

• 加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘,。

為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

• 棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內配制）,，37℃,60分鐘,。
• 溫育60分鐘后,，棄去孔內液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）,。
• 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃,，60分鐘,。
• 溫育60分鐘后，棄去孔內液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
• 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內,，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。
• 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。
• 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

注：

• 每次實驗留一孔作為空白調零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零,。
• 為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜,。
• 未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存。標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用,。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
• 建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內,，浸泡1-2分鐘,，根據需

要，重復此過程數次,。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人E-Selectin,，且與其它相關蛋白無交叉反應,。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數坐標紙上繪出標準曲線,，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數,；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

• 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。
• 一次加樣時間控制在5分鐘內,，如標本數量多,，推薦使用排槍加樣。
• 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。
• 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數,。
• 在配制標準品、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制,，不能混淆,。
• 底物請避光保存。

檢測范圍：

156 pg/ml -10,000 pg/ml

說明

• 試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。
• 有效期：6個月
• 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
• 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質,，此為正常現象,，不會對實驗結果造成任何影響,。
• 中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。