ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素-10

    IL-10主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生,，但Tho細(xì)胞,、Th，細(xì)胞,、CD₈⁺T細(xì)胞,、活化的B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、kupffer細(xì)胞,、肝細(xì)胞,、角化細(xì)胞等也可產(chǎn)生。IL-10參與抑制細(xì)胞合成炎性因子,、集落刺激因子（CSF）等主要負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,，能廣譜抑制單核-巨噬細(xì)胞炎性介質(zhì)ILl、IL-6,、IL-8,、TFN-γ的合成及表達(dá)；在免疫反應(yīng),，可抑制Th：細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2,、IL-3,、TFNγ等,，其機(jī)制可能是通過(guò)與受體結(jié)合改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)途徑而選擇性抑制有關(guān)細(xì)胞因子mRNA的合成，IL-10能抑制Th,，細(xì)胞的增殖及分泌IL-2,、TFN-γ等細(xì)胞因子，抑制Th：細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),。正常肝內(nèi)存在的IL-10就可以通過(guò)上述機(jī)制或直接拮抗TNF等細(xì)胞因子的作用而抑制機(jī)體的抗病毒免疫,，故有抗肝組織炎性損傷的作用。

    [檢測(cè)方法]  ELISA法

    [方法學(xué)原理]  在微孔反應(yīng)板上包被抗人ILlo單克隆抗體,，待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-10會(huì)與抗人IL-10單克隆抗體結(jié)合,，游離的成分被洗去，同時(shí)加人生物素化的抗人IL10抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素,。生物素與親和素特異結(jié)合,，抗人IL-10抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IL-10結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去,。加入顯色劑,，若反應(yīng)孔中有IL-10，HRP會(huì)使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色,，加終止液變黃色,。在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度，IL-10濃度與吸光度成正比,，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出標(biāo)本中

的IL-10濃度,。

    [標(biāo)本準(zhǔn)備]  靜脈血2ml，不抗凝,。

    [試劑]

    1．預(yù)包被微孔反應(yīng)板

    2．濃縮酶結(jié)合物

    3．酶結(jié)合物稀釋液

    4．標(biāo)準(zhǔn)晶和標(biāo)本稀釋液

    5．濃縮生物素化抗體

    6．ILl0標(biāo)準(zhǔn)品

    7．濃縮洗滌液

    8．顯色劑A,、B

    9．終止液

    [儀器]  酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

    （檢測(cè)步驟）

    1．在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測(cè)樣本,、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul,，再加生物素化抗體工作液50rd,。

    2．振蕩混勻，置20～25℃環(huán)境中溫育120min,。

    3．將孔內(nèi)液體吸干,，用洗滌液充分洗滌5次，干燥,。

    4．除空白孔外,，加入酶結(jié)合物工作液100ul。

    5．振蕩混勻,，置20-25C環(huán)境中溫育30min,。

    6．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次,，干燥,。

    7．每孔加入顯色劑A、B各50u1,，輕輕振蕩混勻,，37℃環(huán)境中避光顯色10min。

    8．加入終止液50ul后，輕輕振蕩混勻。用酶標(biāo)儀（450nm波長(zhǎng)）測(cè)定各孔吸光度,，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)照，求出IL-10水平,。

    [正常參考值]  各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測(cè)方法的不同確立正常參考值。

    [注意事項(xiàng)]

    1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用,，未用完的微孔條用自封袋密封保存,。

    2．酶標(biāo)板洗滌時(shí)各孔均需加滿(mǎn)洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈,。應(yīng)設(shè)定30-60s的洗滌浸泡時(shí)間,。

    3．滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻,。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直,，以使滴量準(zhǔn)確。

    4．所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理,。終止液為2mol／L硫酸,，使用時(shí)應(yīng)注意安全。

    5．每批樣本應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),。

    6．檢測(cè)劑工作液按說(shuō)明書(shū)臨用前配置,。

    7．若標(biāo)本吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定范圍以外，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)。

    [臨床意義]  在多發(fā)性硬化急性期IL-10水平處于低值,，而緩解期水平則上升,；SLE患者急性期IL-10 mRNA表達(dá)量明顯增高，緩解期水平則降低,；類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎患者急性期IL-10水平顯著升高,，緩解期水平則降低。

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