單個噬菌體的在新冷凍的組織上進行免疫熒光

[器材和試劑]

●  裝滿10ml冷的新配制的4％多聚甲醛（PFA）的10ml塑料注射器，并附有1英寸（2．54em）、25號針頭（每只鼠一個）

●  為每只鼠準備兩只胰島素注射器

●  為每份器官或組織準備一個6cm的組織培養(yǎng)皿

●  1．25％（w/v）的阿佛丁水溶液

●  10⁹～10¹¹TU或pfu的噬菌體溶液

●  Tissue-Tek O．C．T．（Optimal CuttingTemperature，*切片溫度）包埋劑（Sakura Finetek）

●  Cryomold Stantand（Miles）

●  干冰

●  1×PBS

●  MilliQ水

●  fd一抗：兔抗fd的多克隆IgG（Sigma）

●  T7一抗：兔抗T7的多克隆IgG（Ruoslahti Lab）

●  fd和T7的二抗：羊抗兔IgG—A1exa偶聯(lián)物  （M01ecular PrObes）

●  DAKO抗體稀釋液（含轉(zhuǎn)運蛋白和0．015mol/L NaNs的Tris—HCl緩沖液）

●  28％的蔗糖PBS溶液

●  帶DAPI的VECTASHIELD@組織切片固定劑（Vector Laboratories）

[方法]

A．噬菌體的注射以及組織的制備

1．通過腹腔注射300～500u1的1．25％（w/v）阿佛丁來麻醉小鼠,。

2，將鼠尾置于溫水中，使尾部血管膨脹,。

3．用另外的胰島素注射器注射200ul的噬菌體溶液。

4．讓噬菌體循環(huán)至少5分鐘,。

5．打開胸腔并暴露心臟,。

6．用10～20m1冷的新配制的4％多聚甲醛（PFA）來灌注小鼠。

7．將大塊的器官或腫瘤取出并切成小塊,，并把它們浸泡于4％PFA中,。在4℃下多聚甲醛中固定時間不能超過2小時（注意：這是一個和石蠟固定實驗方案有重大差異的時間）。

8．在28％蔗糖PBS溶液中將固定后的組織4℃孵育過夜,，以冷凍保護,。

9．通過向模子中填充丁iSSLle—Tek O．C.T．包埋劑，然后將1～2塊組織放到模子*,，用Tissue—Tek O．C.T．包埋劑在Cryomold@Standard模子中進行包埋,。把組織塊按到O．C．T．包埋劑的底部，接著用O．C．T．包埋劑將模子*填滿,。把切片置于干冰上冷凍,。封閉物可以保存在-80℃,，直到切成10 um的切片。

B．抗原的封閉

1．如果使用DAKO抗體稀釋液,，就不需進行蛋白封閉,。

C．抗體和復(fù)染

1．在室溫下用1×PBS沖洗10分鐘，用于除去Tissue—TekO．C．T．包埋劑,。

2．用DAKO抗體稀釋液來稀釋一抗（對于多抗比例為l：1000）,，并添加約100u1到切片中（足夠*覆蓋切片的量）。在室溫下孵育1小時,，用1XPBS洗滌切片兩次,。

3．向切片中添加大約100ul（足夠*覆蓋切片的量）預(yù)先稀釋的多克隆二抗（用DAKO抗體稀釋液按1：200稀釋）。在室溫下孵育30分鐘,，用1XPBS洗滌切片3次,。

4．用復(fù)染細胞核的帶DAPI的VECTASHIELD組織切片固定劑將樣品封固在載玻片上。

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