用噬菌體ElISA快速鑒定噬菌體展示蛋白的結(jié)合親和性

    單價噬菌體展示系統(tǒng)能使一個單獨(dú)的蛋白質(zhì)（或多肽）分子呈遞在噬菌體顆粒表面，這樣的蛋白質(zhì)與野生型pⅢ衣殼蛋白相連,，作為融合蛋白在輔助噬菌體感染的大腸桿菌細(xì)胞中,，由噬菌粒載體翻譯表達(dá)出來,。這種展示系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)單價展示，是由于這種融合蛋白極少替代來自輔助噬菌體基因組的野生型pⅢ蛋白,。這種展示可以是高度可變的,，而這時這些噬菌體通常只有0.05％一5％才能真正展示出需要的蛋白質(zhì),。

    單價噬菌體展示的主要優(yōu)點(diǎn)是排除了多價噬菌體展示時會遇到的親和效應(yīng)（avidityeffect）。這樣保證了篩選的性,，能把具有很高親和性（如Kd≈lnmol/L）的不同變異體區(qū)別開來,。這種技術(shù)的應(yīng)用，包括提高了結(jié)合親和性或改變了結(jié)合特異性[1）的多肽的生成,。實(shí)際上,，這個過程中zui費(fèi)勁的部分就是對篩選出的突變蛋白的鑒定。

    現(xiàn)在已有兩種方法能加快對篩選出的蛋白的結(jié)合親和性的分析,。一種方法是在被展示蛋白和作為錨定的pⅢ衣殼蛋白中插入琥珀中止密碼子,，這樣，游離蛋白就能在非（琥珀）抑制性菌株中進(jìn)行表達(dá),。這樣便能使用分析結(jié)合性的標(biāo)準(zhǔn)方法,，對于提率是一種改進(jìn)[61。不幸的是,，這個方法的應(yīng)用受到一種趨勢的影響,，即由有義密碼子（sense codon）代替琥珀終止密碼子而產(chǎn)生的變異體在篩選出的文庫中占優(yōu)勢，因為由于融合蛋白的表達(dá)和展示的提高,，這種噬菌體具有巨大的選擇優(yōu)勢,。尋找一個替代的方法，以忽略終止密碼子并能將每個基因都亞克隆人一個表達(dá)載體,，顯然是更費(fèi)力的,。

    第二種方法，也是本章的重點(diǎn),，是將噬菌體顆粒本身作為游離蛋白的替代物,，以測定結(jié)合性。通過在溶液中不斷地加入靶標(biāo)蛋白,，來競爭替代與噬菌體結(jié)合的固定化靶標(biāo)蛋白,，然后進(jìn)行噬菌體結(jié)合性檢測。這種技術(shù)能快速地分析從單價噬菌體展示系統(tǒng)的篩選中分離出的變異體,，也能用于評價那些用其他方法難以表達(dá)的定向變異體的親和性,。用噬菌體結(jié)合性檢驗方法來對結(jié)合親和性進(jìn)行評估是很困難的，因為一個關(guān)鍵的變量,，即被展示的蛋白質(zhì)的濃度是未知的,。不過，對于一系列的變異體,，則有可能得到ECso的比值,，而這與它們的解離常數(shù)的比值是緊密相關(guān)的[7）。本章主要描述了在設(shè)計噬菌體結(jié)合性檢測時需要考慮的一些重要參數(shù)，并為怎樣進(jìn)行這些檢測提供了詳細(xì)的示例實(shí)驗方案,。

    噬菌體結(jié)合性檢測為鑒定大量的噬菌體并挑選出對后續(xù)實(shí)驗zui合適的變異體提供了一種快速的方法,。這種檢驗對于了解噬菌體展示技術(shù)的潛力同樣是一個有效的手段。然而,，噬菌體結(jié)合性檢測并不能zui終測定結(jié)合的親和性,。無數(shù)的因素都能影響到結(jié)合的結(jié)果，包括噬菌體上融合蛋白的展示水平,、未知的翻譯后修飾以及由展示蛋白的增加引起的親和效應(yīng)等,。為了消除與噬菌體展示相關(guān)的可能的假象，有必要使用傳統(tǒng)的對純化后蛋白結(jié)合性的分析方法,，對這些檢測試驗鑒定出的*變異體進(jìn)行檢驗和鑒定,。

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