ELISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子

    腫瘤壞死因子（TNF）是由激活的單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞受內(nèi)毒素刺激后產(chǎn)生的一種分子量為17 000的蛋白質(zhì),。其中，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的稱(chēng)TNF-α,，是巨噬細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)的細(xì)胞因子,；由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的稱(chēng)TNF-β。TNF在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)活性：可作為免疫應(yīng)答中的一種中間介質(zhì),，既有抗病效應(yīng),，又有致病效應(yīng)；可引起腫瘤的出血壞死,；可刺激成纖維細(xì)胞增殖,；可增加HLA-A、HLA-B,、HLA-C抗原的表達(dá),；可激活中性粒細(xì)胞及殺傷細(xì)胞；可促進(jìn)B細(xì)胞增殖及分化,、增加IL-2受體表達(dá)。肝臟是TNF的主要發(fā)源地,，同時(shí)也是TNF清除的主要部位,。目前，以TNF-α在臨床的意義較大,，是內(nèi)毒素引起肝損害的重要介質(zhì),。TNF-α只有通過(guò)與靶細(xì)胞表面的膜型受體（mTNF-aR）特異結(jié)合才能發(fā)揮毒性效應(yīng)，這一結(jié)合過(guò)程又

受血清中可溶性TNF-α受體（sTNF-aR）的調(diào)節(jié)和制約,，而sTNF-aR可與mTNF-aR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TNF-,。。臨床上常以檢測(cè)TNF-α為主,。

    [檢測(cè)方法]  ELISA法

    [方法學(xué)原理]  在微孔反應(yīng)板上包被抗人TNF-α單克隆抗體,，待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的TNF-a會(huì)與單克隆抗體結(jié)合，游離的成分被洗去,，同時(shí)加入生物素化的抗人TNF-α抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素,。生物素與親和素特異結(jié)合,，抗人TNF抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人TNF-α結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去,。加入顯色劑,，若反應(yīng)孔中有TNF-α，HRP會(huì)使無(wú)色的顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色,，加終止液變黃色,。在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度，TNF濃度與吸光度成正比,，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出標(biāo)本中的TNF-α濃度,。

    [標(biāo)本準(zhǔn)備]  靜脈血2ml,，不抗凝,。

    [試劑]

    1．預(yù)包被微孔反應(yīng)板

    2．濃縮酶結(jié)合物

    3．酶結(jié)合物稀釋液

    4．標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液

    5．濃縮生物素化抗體

    6．IFN標(biāo)準(zhǔn)晶

    7．濃縮洗滌液

    8．顯色劑A,、B

    9．終止液

    [儀器]  酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,。

    [檢測(cè)步驟]

    1．在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測(cè)樣本,、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100txl,，再加生物素化抗體工作液50tzl,。

    2．振蕩混勻,，置20-25℃環(huán)境中溫育120min,。

    3．將孔內(nèi)液體吸干,，用洗滌液充分洗滌5次，干燥,。

    4．除空白孔外,，加入酶結(jié)合物工作液100u1。

    5．振蕩混勻,，置20-25℃環(huán)境中溫育30min,。

    6．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次,，干燥,。

    7．每孔加入顯色劑A、B各50ul,，輕輕振蕩混勻,，37C環(huán)境中避光顯色10min。

    8．加入終止液50ul后,，輕輕振蕩混勻,。用酶標(biāo)儀（450nm波長(zhǎng)）測(cè)定各孔吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)照,，求出TNF值,。

    [正常參考值]  各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測(cè)方法的不同確立正常參考值。

    [注意事項(xiàng)]

    1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用,，未用完的微孔條用自封袋密封保存,。

    2,。酶標(biāo)板洗滌時(shí)各孔均需加滿(mǎn)洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈,。應(yīng)設(shè)定30～60s的洗滌浸泡時(shí)間,。

    3．滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻,。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直,，以使滴量準(zhǔn)確。

    4．所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理,。終止液為2mol／L硫酸,，使用時(shí)應(yīng)注意安全。

    5．每批樣本應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),。

    6．若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定范圍以外,，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)。

    [臨床意義]  類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,、多發(fā)性硬化,、惡性腫瘤、器官移植患者血清TNF升高,。

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