人骨退化特異標(biāo)志物（CTX-2）ELISA試劑盒使用說(shuō)明書

本試劑盒僅供體外研究使用                

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定人血清,、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中骨退化特異標(biāo)志物（CTX-2）含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗CTX-2抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗CTX-2抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的CTX-2呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為5,000 pg/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋

5,000 pg/ml,，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml,，625 pg/ml,，312 pg/ml，156 pg/ml,，78 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制2,500 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）5,000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6.         檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10ul檢測(cè)溶液A加990ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。

7.         檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標(biāo)本的采集及保存

1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,，-20℃不應(yīng)超過3個(gè)月，-80℃不應(yīng)超過6個(gè)月,；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)；高血脂的標(biāo)本不需進(jìn)行特殊處理,，可直接檢測(cè),。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲坪盟性噭?；試劑或樣品稀釋時(shí),，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡,。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時(shí)，均應(yīng)用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍,。建議各實(shí)驗(yàn)室在操作前*行預(yù)實(shí)驗(yàn)以建立*稀釋倍數(shù)。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.         棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

4.         每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100ul，37℃,，60分鐘,。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng),，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè),。

注：

1.  每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔）,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4,。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。

2.  嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室 溫,。使用后立即冷藏保存試劑,。

3.  洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入檢測(cè)溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，避免酶標(biāo)板長(zhǎng)時(shí)間處于干燥狀態(tài)。

4.  消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。

5.  在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

6.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請(qǐng)于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液,、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,，請(qǐng)配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí),，一次不要小于10ul）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；檢測(cè)液A,、B,，以及底物溶液在使用前，應(yīng)置于37℃溫育30分鐘,；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。

7.  建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人骨退化特異標(biāo)志物（CTX-2），且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng),。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,，如curve expert 1.3）,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1.         洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性,。

2.         一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣,。

3.         請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。

4.         如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高,，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5.         在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

6.         底物請(qǐng)避光保存。

檢測(cè)范圍：78 pg/ml - 5,000 pg/ml

zui低檢測(cè)限：19.5 pg/ml

說(shuō)明

1.          在儲(chǔ)存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果,。

2.          小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度,。請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。

3.          試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。

4.          濃洗滌液會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。

5.          剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。

6.          中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處,，請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn),。

7.          所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置,。

8.          有效期：6個(gè)月

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