ELISA測(cè)定的常用模式五--競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體
 

    抗體的測(cè)定一般不使用競(jìng)爭(zhēng)法,。當(dāng)抗原中雜質(zhì)難以去除或抗原的結(jié)合特異性不穩(wěn)定時(shí),，可采用這種模式測(cè)定抗體,。如乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗體（HBe·Ab）的測(cè)定，由于e抗原較核心抗原僅多29個(gè)氨基酸,，e抗原很容易轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵目乖?，因此?span lang="EN-US">HBcAb和HBeAb的測(cè)定均采用競(jìng)爭(zhēng)法。但其測(cè)定具體模式有區(qū)別,?？乖墓滔嗷瓤梢灾苯舆M(jìn)行，亦可以通過(guò)相應(yīng)特異抗體而間接固相化,。下面就HBcAb和HBeAb ELISA測(cè)定具體操作步驟分述如下,。

    1．HBcAb的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定

    （1）先將HBcAg在碳酸鹽緩沖液中4~C過(guò)夜包被，形成固相抗原,，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗體后,，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì),。

    （2）同時(shí)加入待測(cè)樣本和酶標(biāo)的特異抗體,，溫育一定時(shí)間后洗板；此步中,，待測(cè)樣本的抗體將與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相上特異抗原結(jié)合,。

    （3）加入酶底物，溫育顯色測(cè)定,，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比（圖2-8）

2.HBeAb的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定

    （1）先將HBeAb在碳酸鹽緩沖液中4℃過(guò)夜包被,，形成固相抗體,，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉,，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì),；

    （2）同時(shí)加入待測(cè)樣本和中和抗原HBeAg，溫育一定時(shí)間后洗板,；此步中,，待測(cè)樣本的抗體將與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合與中和抗原HBeAg，待測(cè)樣本中HBeAb濃度越高,，則與固相HBe—Ab結(jié)合的HBeAg越少,，反之亦然；

    （3）加入酶標(biāo)的特異抗體,，溫育一定時(shí)間后洗板,；此步中，酶標(biāo)抗體將與結(jié)合于固相抗體上的特異抗原結(jié)合,；

    （4）加入酶底物,，溫育顯色測(cè)定，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比（圖2-9）

    HBeAb之所以要采用此種模式測(cè)定,，主要是HBeAg的不穩(wěn)定所致,，如在固相直接包被HBeAg，則會(huì)因?yàn)?span lang="EN-US">HBeAg向HBcAg的易轉(zhuǎn)變性,，而導(dǎo)致測(cè)定誤差,。

    抗體的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定不同于只有單個(gè)抗原決定簇的小分子抗原的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定，其測(cè)定的可靠性,，在很大程度上受競(jìng)爭(zhēng)抗體的特異性和親和力大小的影響,，競(jìng)爭(zhēng)抗體與待測(cè)抗體在結(jié)合的特異性及親和力越接近一致，則測(cè)定的可靠性越強(qiáng),，但競(jìng)爭(zhēng)用抗體均為相應(yīng)抗原免疫動(dòng)物所得,，與機(jī)體感染病毒后所產(chǎn)生的抗體肯定會(huì)有所差異，因而,，在目前HBeAb和HBcAb的臨床檢測(cè)中,，常有難以解釋的測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)，這與其在方法學(xué)上的固有缺陷是分不開的,。

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