免疫熒光（IF）細胞化學(xué)染色方法--新手適用

免疫熒光（IF）細胞化學(xué)染色方法

一,、標(biāo)本制作

　　可制作涂片,、印片、細胞單層培養(yǎng)物,、組織切片,，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定，作免疫熒光染色用,。

二,、熒光抗體染色方法

　　（一）直接法

　　1．染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等）,，在室溫或37℃染色30min,，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥,。

　　2．洗片 　傾去存留的熒光抗體,，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌,，每次5min,，再用蒸餾水洗1min,，除去鹽結(jié)晶。

　　3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固,、鏡檢

　　4．對照染色

　　①正常免熒光血清染色,，如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性,。②染色抑制試驗（一步法）：將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合,，如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性,。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致,，可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清，染色結(jié)果應(yīng)為陽性,。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定,。③類屬抗原染色試驗，前面已作敘述,。

　　直接法比較簡單,，適合做細菌、螺旋體,、原蟲,、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究,。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原,，特異性高而敏感性較低。

　　（二）間接法

　?。?span lang="EN-US">1）切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上,，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min,。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次,，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體,。

　?。?span lang="EN-US">2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟,，染色30min,，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min,，攪拌,，緩沖甘油封固，鏡檢,。

　　對照染色：①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清,，再用上法進行染色,，結(jié)果應(yīng)為陰性。②抗原對照：即類屬抗原染色,，亦應(yīng)為陰性,。③陽性對照,。

　　間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）,。另一種稱夾心法,，即用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上,，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在,，方法步驟如下：

　　①切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi),。

　　②滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃,，30min。

　　③緩沖鹽水洗2次,，每次5min,，吹干。

　　④滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃,，30min。

　　⑤如③水洗,。

　　⑥緩沖甘油封固,，鏡檢。

　　間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原,，敏感性較高,，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查,，所以已被廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的試驗,。

　　（三）補體法

　　1．材料

　　（1）免疫血清60℃滅活20min,，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2,，1：4，1：8……,。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清,，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色,。免疫血清補體結(jié)合的效價,，如為1：32則免疫血清應(yīng)作1：8稀釋。

　?。?span lang="EN-US">2）補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結(jié)合反應(yīng)試管法所測定的結(jié)果,，按2單位的比例,，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4,、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中,，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

　?。?span lang="EN-US">3）抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4,，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價,，然后按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用,。

　　2．方法步驟

　　（1）涂片或切片固定,。

　?。?span lang="EN-US">2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補體之等量混合液（此時免疫血清及補體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min,，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi),。

　　（3）用緩沖鹽水洗2次,，攪拌,，每次5min，吸干標(biāo)本周圍水液,。

　?。?span lang="EN-US">4）滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補體熒光抗體30min，37℃,，水洗同（3）,。

　　（5）蒸餾水洗1min,，緩沖甘油封固,。

　　3．對照染色

　　（1）抗原對照,。

　?。?span lang="EN-US">2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。

　?。?span lang="EN-US">3）滅活補體對照：將補體經(jīng)56℃30min處理后,，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后,，進行補體法染色,。

　　本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用,，敏感性亦較

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