流式細(xì)胞術(shù) FCM 介紹及簡(jiǎn)易操作步驟--新手適用

一. 流式細(xì)胞術(shù)概述

     流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry,， FCM）是七十年代發(fā)展起來(lái)的高科學(xué)技術(shù),，它集計(jì)算機(jī)技術(shù),、激光技術(shù),、流體力學(xué),、細(xì)胞化學(xué),、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,， 同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能,。它不僅可測(cè)量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,，還可檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原,、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等,，可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析,， 在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)分析大量細(xì)胞，并收集,、儲(chǔ)存和處理數(shù)據(jù),，進(jìn)行多參數(shù)定量分析; 能夠分類(lèi)收集（分選）某一亞群細(xì)胞，分選純度＞95%,。在血液學(xué),、免疫學(xué)、腫瘤學(xué),、藥物學(xué),、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。
國(guó)內(nèi)使用的流式細(xì)胞儀主要由美國(guó)的兩個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn): Becton-Dickinson公司（簡(jiǎn)稱(chēng)B-D公司）和BECKMAN- COULTER公司,。流式細(xì)胞儀主要有兩型:臨床型（又稱(chēng)小型機(jī),、臺(tái)式機(jī)）和綜合型（又稱(chēng)大型機(jī)、分析型）,。B-D公司產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur,。BECKMAN-COULTER公司產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測(cè)分析功能外,，還具有細(xì)胞分選功能,，多用于科學(xué)研究。

二.流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)

1．流式細(xì)胞儀的分析速度：
一般流式細(xì)胞儀每秒檢測(cè)1000～ 5000個(gè)細(xì)胞,，大型機(jī)可達(dá)每秒上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,。
2．流式細(xì)胞儀的熒光檢測(cè)靈敏度：一般能測(cè)出單個(gè)細(xì)胞上<600個(gè)熒光分子，兩個(gè)細(xì)胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分,。
3．前向角散射（FSC）光檢測(cè)靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測(cè)細(xì)胞的大小,，一般流式細(xì)胞儀能夠測(cè)量到0.2μm～０.5μm。
4．流式細(xì)胞儀的分辨率：通常用變異系數(shù)CV值來(lái)表示,，,，一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%，這也是測(cè)量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時(shí)要求必須達(dá)到的,。
   5．流式細(xì)胞儀的分選速度：一般流式細(xì)胞儀分選速度＞1000個(gè)/秒,，分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。

        三.流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理    流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀主要由以下五部分構(gòu)成:①流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)②激光光源及光束形成系統(tǒng)③光學(xué)系統(tǒng)④信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ),、顯示,、分析系統(tǒng)⑤細(xì)胞分選系統(tǒng)。
流動(dòng)室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式細(xì)胞儀的核心部件,，流動(dòng)室由石英玻璃制成,，單細(xì)胞懸液在細(xì)胞流動(dòng)室里被鞘流液包繞通過(guò)流動(dòng)室內(nèi)的一定孔徑的孔，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心,，細(xì)胞在此與激光垂直相交,，在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)。流動(dòng)室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動(dòng),，控制鞘液流的裝置是在流體力學(xué)理論的指導(dǎo)下由一系列壓力系統(tǒng),、壓力感受器組成，只要調(diào)整好鞘液壓力和標(biāo)本管壓力,， 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線(xiàn)方向,，能夠保證每個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準(zhǔn)確無(wú)誤,。見(jiàn)圖12.1流動(dòng)室示意圖,。流動(dòng)室孔徑有60μm、100μm,、150μm ,、250μm等多種，供研究者選擇,。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動(dòng)室,。

圖12.1流動(dòng)室示意圖（采自Coulter Training Guide）

      四. 流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理    激光光源及光束形成系統(tǒng)

    流式細(xì)胞儀可配備一根或多根激光管,，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長(zhǎng)488ηm,，此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長(zhǎng)633ηm）和/或紫外激光管,。

流式細(xì)胞儀的主要測(cè)定信號(hào)熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與激發(fā)光的強(qiáng)度和照射時(shí)間相關(guān),，激光是一種相干光源,，它能提供單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度,、高穩(wěn)定性的光照,，正是能達(dá)到這一要求的理想的激發(fā)光光源。
    在激光光源和流動(dòng)室之間有兩個(gè)圓柱形透鏡,，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束（22μm×66μm）,，在這種橢圓形激光光斑內(nèi)激光能量成正態(tài)分布，使通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)的細(xì)胞受照強(qiáng)度一致,。

五. 流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理    光學(xué)系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡,、小孔、濾光片組成,，大致可分

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