Western Blot 蛋白印跡法 --詳細(xì)中文操作指南（新手適用）

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這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體,，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之,。Western使用的探針是抗體,，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng),。這種技術(shù)的作用是對非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定,。

儀器：高壓鍋,、玻璃勻漿器、高速離心機(jī),、分光光度儀,、—20℃低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置,、恒溫水浴搖床,、多用脫色搖床。

試劑：單去污劑裂解液,、0.01mol/L PBS （pH7.3）、10％分離膠,、4％濃縮校,、G250考馬斯亮藍(lán)溶液、0.15mol/L NaCl 溶液,、2X（5X）SDS上樣緩沖液,、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液,、10X麗春紅染液,、封閉液、TBST,、TBS,、洗脫抗體緩沖液、顯影液,、定影液,、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑,。

雜品與耗材：各種規(guī)格的吸頭,、離心管和加樣器；各種規(guī)格的燒杯,、量筒和平皿等玻璃器材,；硝酸纖維素膜，乳膠手套,，保鮮膜,，搪瓷盤（>20×20cm）,，X-光片夾，X-光片,，玻棒長短各一根,，計時器，吸水紙,，

試劑配制：

（一）母液

1.0mol/L Tris·HCl

Tris （MW121.14） 30.29g

蒸餾水           200ml

溶解后,，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點（見下所示），zui后用蒸餾水定容至250ml,，高溫滅菌后室溫下保存,。

PH                     HCl

7.4                    約17ml

7.5                    約16m

7.6                    約15ml

8.0                    約10ml

1.74mg/ml （10mmol/L）PMSF

PMSF         0.174g

異丙醇       100ml

溶解后，分裝于1.5ml離心管中,，－20℃保存,。

0.2mol/L NaH₂PO₄

NaH₂PO₄（MW119.98）    12g

蒸餾水            至 500ml

溶解后，高壓滅菌,，室溫保存,。

0.2mol/LNa₂HPO₄

Na₂HPO₄·12H2O（MW 358.14）  71.6g

蒸餾水              至1000ml

溶解后，高壓滅菌,，室溫保存,。

10％SDS

SDS       10g

蒸餾水    至100ml

50℃水浴下溶解，室溫保存,。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀,，水浴溶化后，仍可使用,。

10％過硫酸胺（AP）

過硫酸胺   0.1g

超純水    1.0ml

溶解后,，4℃保存，保存時間為1周,。

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）

Tris （MW121.14）   45.43g

超純水            200ml

溶解后,，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，zui后用超純水定容至250ml,，高溫滅菌后室溫下保存,。

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）

Tris （MW121.14）  15.14g

超純水            200ml

溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8,，zui后用超純水定容至250ml,，高溫滅菌后室溫

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