IHC（P） 免疫組化石蠟切片操作規(guī)程 ――（新手適用）

免疫組化操作規(guī)程――石蠟切片

（一）、儀器設(shè)備

    1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐,；

    2）水浴鍋

（二）、試劑

    1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L,，KCl 2.7mmol/L,，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L,。

    2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB,，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g,，檸檬酸 0.4g,。

    3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。

    4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿,，用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml,。

    5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制,。 b,、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

    6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制,。

    7）封裱劑：

    a,、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；

    b,、油和TBS（或PBS）配制,。 

    8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標(biāo)本,；pH7.0～7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本,。

（三）、操作流程

    1,、脫蠟和水化

    脫蠟前,，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

    1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,，更換二甲苯后再浸泡10分鐘,；

    2）無水乙醇中浸泡5分鐘；

    3）95%乙醇中浸泡5分鐘,；

    4）70%乙醇中浸泡5分鐘,；

    2、抗原修復(fù)

   用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片,。

   1）抗原熱修復(fù)

   （1）高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）,。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定,。將玻片置于金屬染色架上,，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘,，然后將蓋子鎖定,，小閥門將會升起來。10分鐘后,，去除熱源,，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子,。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù),。

   （2）煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右,，放入組織芯片加熱10~15分鐘。

   （3）微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入,，斷電,，間隔5~10分鐘，反復(fù)1-2次,。適用的抗原有：AR,，Bax，Bcl-2,，C-fos,，X-jun，C-kit,，C-myc,，E-cadherin，Chromogranin A,，Cyclin,，ER，Heat shock protein,，HPV,，Ki-67，MDMZ,，p53,，p34，p16,，p15,，P-glycoprotein，PKC,，PR,，PCNA，ras,，Rb，TopoismeraseⅡ等,。

   2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液,。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃,，消化時間約為5~30分鐘,；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原,，其中有：Collagen,，Complement,，Cytokeratin，C-erB-2,，GFAP,，LCA，LN等,。

抗原修復(fù)注意事項：

1）載玻片的處理：

    抗原修復(fù)過程中,，由于高溫、高壓,、輻射等諸多因素的影響,，極易造成脫片。為保證試驗的正常進(jìn)行,，可選用PES,、Poly-L-Lysine等試劑，對已清洗的載玻片進(jìn)行處理,。具體方法如下：

1.1 APES：現(xiàn)用現(xiàn)配,。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘,，取出稍停片刻,，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可,。用此載玻片撈片時應(yīng)注意組織要一步到位,，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果,。

1.2 Poly-L-Lysine：將洗凈,、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘,，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥,。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品,。

2）常用酶消化：

2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%,，消化時間為37℃、10~40分鐘,，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示,。

2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃,、30~180分鐘,，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白）,，Collagen IV（IV型膠原）等,。

2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10?g/ml的saponin溶液,，消化時間為室溫孵育30分鐘。

3）抗原熱修復(fù)：

可根據(jù)實驗室的具體條件,，選用微波爐抗原修復(fù),、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液,，如TBS、PBS,、重金屬鹽溶液等,，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果,。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制,，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻,，其pH值在6.0 ± 0.1,，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調(diào)整,。

3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后,，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3,。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中,，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件,，務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）,。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻,，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）,。PBS洗，下接免疫組化染色步驟,。

3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水,。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上,，放入鍋內(nèi),，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥,。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鐘后），計時1~2分鐘,，然后將壓力鍋端離熱源,，冷水沖至室溫后,，取下氣閥，打開鍋蓋,，取出切片,，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3,，下接免疫組化染色步驟,。

3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中,，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中,，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計時15~20分鐘,，然后端離電爐,，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗,，PBS洗,，下接免疫組化染色步驟。

    3,、免疫組織化學(xué)染色

    SP法

    1）脫蠟,、水化；

    2）PBS洗2～3次各5分鐘,；

    3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上,，室溫靜置10分鐘；

    4）PBS洗2～3次各5分鐘,；

    5）抗原修復(fù),；

    6）PBS洗2～3次各5分鐘；

    7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘,。甩去多余液體,。

    8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時,。

    9）4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘,。

    10）PBS洗3次各5分鐘；

    11）滴加Ⅱ抗40～50μl,，室溫靜置,，或37℃1小時；

    12）II抗中可加入0.05%的tween-20,。

    13）PBS洗3次各5分鐘,；

    14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度,；

    15）PBS或自來水沖洗10分鐘,；

    16）蘇木精復(fù)染2分鐘,，鹽酸酒精分化；

    17）自來水沖洗10～15分鐘,；

    18）脫水,、透明、封片,、鏡檢,。

    SABC法

    1）脫蠟、水化,。

    2）PBS洗兩次各5分鐘,。

    3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘,，蒸餾水洗3次,。

    4）抗原修復(fù)。

    5）PBS洗5分鐘,。

    6）滴加正常山羊血清封閉液,，室溫20分鐘。甩去多余液體,。

    7）滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）,。

    8）PBS洗三次每次2分鐘。

    9）滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘,。

    10）PBC洗3次每次2分鐘,。

    11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘,。

    12）PBS洗4次每次5分鐘,。

    13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

    14）蒸餾水洗,。蘇木素復(fù)染2分鐘,、鹽酸酒精分化。

    15）脫水,、透明,、封片、鏡檢,。

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