基本信息

細(xì)胞名稱 : MOC1細(xì)胞系

T150燒瓶 : 07-200-64

T75燒瓶 : 10-126-37

冷 凍 劑 : 03-374-059

45um過濾器 : 09-754-21

惰性譜線 : MOC1,22

侵略性線 : MOC2

IMDM : sh30228.02 Hams

營(yíng)養(yǎng)混合物 : F10-F12sh30026.01胎牛血清,，特征-海克隆

目錄 / 批次號(hào) : sh30071.03 / AWK24001

過濾1L過濾器瓶的過濾器 : 09-761-108

科學(xué)試劑目錄編號(hào) : 胰島素：I6634-50mg　H0135-1mg　　　

EMD微孔試劑目錄編號(hào) : 表皮生長(zhǎng)因子(EGF）,，重組人：01-107

解凍細(xì)胞系

1. 在解凍前,，將21ml IMDM MOC線培養(yǎng)基加入到T150中(如果想解凍成T75，則將10ml加入到T75 中）

2. 將液氮從冷凍瓶中取出,，噴上含有70%酒精的小瓶進(jìn)行清洗,。

3.將冷凍瓶的下半部分放在37攝氏度的水浴中(不讓蓋子接觸水，以避免污染）,，直到 有一小塊冰漂浮著,。

4.再次用ETOH噴灑冷凍瓶，然后放在引擎蓋上,。將1ml培養(yǎng)液移液管加入到1ml細(xì)胞中,，并將這 些2ml加入到已經(jīng)含有培養(yǎng)基的T150中(使一個(gè)T150總共有22ml）。

5.在T150燒瓶中取一些培養(yǎng)基,，沖洗冷凍瓶,，然后平板放置，以確保所有殘留的細(xì)胞都留在冷 凍瓶中,。

冷凍細(xì)胞系

1. 從T150中收集細(xì)胞,，如下圖所示

2. 在15ml錐形管中旋轉(zhuǎn)成顆粒(1000 RPM x5分鐘）

3. 排出上清液

4. 點(diǎn)擊15ml圓錐形管，重懸細(xì)胞

5. 加入1.5ml IMDM MOC系培養(yǎng)基,，在培養(yǎng)基中重建細(xì)胞-保持冰上

6. 管入冰時(shí)緩慢加入1.5 ml冷凍介質(zhì)(在IMDM MOC線介質(zhì)中制作冷凍介質(zhì)-20%DMSO,。例：20ml庫存-加入16ml IMDM MOC線培養(yǎng) 基和4ml DMSO,。注射器過濾器，使用um過濾器

7. 每份1毫升到3個(gè)冷凍瓶

8. 在-80攝氏度內(nèi)儲(chǔ)存不超過2周

9. 在1-2周內(nèi)放入液氮溶液中

注 ： 如果需要,，可增加到2ml IMDM和2ml冷凍培養(yǎng)基,，以儲(chǔ)存在4個(gè)小瓶中。此外,，最好在冷凍細(xì)胞 前計(jì)數(shù)細(xì)胞并記錄在小瓶上,。

細(xì)胞系特征

1. 惰性- MOC1：基于體內(nèi)研究的侵襲性較低。如果從80%合流T150通過1：12,，需要2-4天才能達(dá)到80%合 流,。與更具侵襲性的細(xì)胞系相比，MOC1細(xì)胞系在收獲時(shí)需要的時(shí)間更長(zhǎng),。

2. 侵襲性- MOC2：基于體內(nèi)研究,，更具侵襲性。如果從80%合流T150通過1：12,，需要2-4天才能達(dá)到 80%合流,。與惰性細(xì)胞系相比，惰性細(xì)胞系更容易從燒瓶中分離出來,。

從T150收集和傳遞細(xì)胞/80%融合

1. 將T150中的介質(zhì)倒入傾倒瓶中

2. 用10-20ml PBS清洗一次,。倒出PBS清洗液。

3. 加入1.5ml 0.05%,，確保覆蓋整個(gè)表面積,，從而接觸所有細(xì)胞(這樣做，使細(xì)胞不會(huì)暴露在中太久）,，然后再應(yīng)用1,。5ml0.25%。

4. 放置在37C培養(yǎng)箱中,。侵襲性細(xì)胞系孵育3-4分鐘,，惰性反應(yīng)可達(dá)10-12 min，但在6-8 min后 檢查,。

５. 故意敲擊燒瓶一側(cè)的手掌幾次,，使細(xì)胞松動(dòng)。

6. 在顯微鏡下檢查,，看細(xì)胞在培養(yǎng)基中是否能自由漂浮,。如果大多數(shù)沒有，請(qǐng)放回37C培養(yǎng)箱中 再放置3-5分鐘,。盡量不要讓細(xì)胞在中停留,，因?yàn)檫@樣會(huì)殺死細(xì)胞。

7. 一旦所有或大部分細(xì)胞漂浮，加入10ml IMDM MOC線培養(yǎng)基來中和反應(yīng),。

8. 移液管培養(yǎng)基和細(xì)胞從燒瓶中進(jìn)入15ml的錐形細(xì)胞到顆粒細(xì)胞,。離心機(jī)，1000 RPM x 5 min,。

9. 倒出上清液,。

10. 以1：12的速度通過細(xì)胞-在另外12毫升的培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。

1１. 從其中取出1ml,，放入新的T150燒瓶中,，總體積為22ml的IMDM MOC系培養(yǎng)基(稀釋1：12）

1２. 放回37C的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng),。應(yīng)在2-4天內(nèi)達(dá)到80%的合流率,。

注入小鼠側(cè)腹(異位）所需細(xì)胞濃度：

MOC1，MOC22：(用0.15ml注射1e6細(xì)胞）=6.66e6細(xì)胞/ml

MOC2：(用0.15ml注射1e5細(xì)胞）=6.66e5細(xì)胞/ml

1. 用0獲取細(xì)胞,。如上所述,。

2. 用IMDM MOC系培養(yǎng)基中和后，將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)成50ml錐形的顆粒(1000 RPM x5分鐘）,。 注：使用50ml錐形,，允許小尺寸針抽出細(xì)胞供注射。

3. 用10ml冰水PBS重懸細(xì)胞顆粒(確保盡可能多地去除含有FCS的介質(zhì)）,，再次將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)成顆 粒(1000 RPM x5分鐘）

4. 用3-6 ml冰PBS重懸細(xì)胞顆粒再次清洗細(xì)胞(體積取決于顆粒的大小,，因?yàn)槟銓⑹褂眠@個(gè)體積 來計(jì)數(shù)細(xì)胞）

5. 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)每毫升的細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)來消除死亡細(xì)胞,。使用 存在的細(xì)胞總數(shù)(細(xì)胞/mlx總PBS的mlPBS）,，計(jì)算重懸細(xì)胞顆粒所需的體積，以達(dá)到6.66e6(MOC1,，MOC22）或6.66e5 cell/ml(MOC2）濃度,。

例如：MOC1的細(xì)胞計(jì)數(shù)為： 2.8e6細(xì)胞/mlx5ml(PBS）=14e6細(xì)胞總數(shù)。14e6細(xì)胞/ 6.66e6細(xì)胞/ml=2.1mlPBS將細(xì)胞顆粒懸浮在其中,。

6. 再次將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)成小顆粒,。倒出PBS上清液(不）。在計(jì)算體積的冰PBS中重懸顆粒以達(dá)到 適當(dāng)?shù)臐舛?，記住灌注上清?0ml錐形中還有 200ul,。

7. 將50ml錐形冰轉(zhuǎn)移，每只小鼠皮下注射0.15ml(150ul）細(xì)胞,。

8. 按照標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議注入鼠標(biāo),。MOC1細(xì)胞系我們用1毫升注射器。我們用1.5英寸21號(hào)針繪制細(xì)胞,，并將針切換 到?英寸26號(hào)針進(jìn)行注射,。

1L媒體協(xié)議將培養(yǎng)基為2：1 IMDM制成營(yíng)養(yǎng)混合物

1. 解凍胎牛血清和賓州/鏈球菌在37攝氏度

2.1L過濾瓶加入626ml IMDM和313ml營(yíng)養(yǎng)混合物

3.添加50毫升FCS

4.添加10ml Penn流

5.過濾器

6.加入1ml5mg/ml胰島素(或500ul，10mg/ml)

注：

用10ml無菌H20稀釋胰島素50mg粉末，加50ul無菌1N鹽酸,，4C箔保存

7.加入40ug

注：將Sigma中氫酮稀釋1mg粉制成19ml無血清IMDM和1ml 100%乙醇,，制成20ml。每升使用800ul,。在-20處存儲(chǔ)等分,。

8.添加5ug EGF

注：

使EGF - make 1ug/ul原液用無血清IMDM稀釋，每升加入5ul,。在-80處存儲(chǔ)等分,。