本產(chǎn)品僅用于科研,，不用于臨床

三聚氰胺檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）

 1 三聚氰胺檢測試劑盒原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測奶粉,、牛奶、組織,、飼料,、蛋類、血清等樣本中的三聚氰胺（Melamine,，MEL）,，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物,、抗體,、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時,，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液,，樣本中的三聚氰胺和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標(biāo)記物后,，用TMB底物顯色,，樣本吸光度值與其所含三聚氰胺含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中三聚氰胺的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：2ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃,，30min～15min
2.3 檢測下限：
奶粉……………………………………40ppb
牛奶……………………………………54ppb
牛奶/奶粉（處理法二）………………2ppb
組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）………4ppb
飼料……………………………………200ppb
蛋類……………………………………40ppb
血清……………………………………8ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
三聚氰胺………………………………100%
三聚氰酸………………………………60%
三嗪,、三嗪二銨………………………<1%
 2.5 樣本回收率：
牛奶、奶粉………………………90%±20%
組織………………………………85%±20%
飼料………………………………85%±20%
蛋類………………………………80%±20%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml
0ppb,、2ppb,、6ppb、18ppb,、54ppb,、162ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：1ppm…………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī),、均質(zhì)器 ,、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器,、離心機(jī),、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl,，100µl-1000µl,、多道300µl
4.3 試劑：乙腈、氫氧化鈉,、濃鹽酸,、正己烷、甲醇 
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,，以避免污染干擾實驗結(jié)果,。
5.2 配液：
配液1：1M HCl 溶液
    取8.6ml濃HCl加去離子水至100ml。
配液2：乙腈-0.1M NaOH溶液 
    84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻,。
配液3：0.1M NaOH 溶液
    稱取0.4g NaOH加去離子水至100ml,。
配液4：1M NaOH 溶液
    稱取4g NaOH加去離子水至100ml。
配液5：復(fù)溶液
    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋,，用于樣本的復(fù)溶,，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 牛奶樣本處理方法：
1）取牛奶樣本600µl到2ml的離心管中,，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻,；4000r/min離心5min,；
2）取100µl上清液，加入900µl復(fù)溶液,，混勻,；
3）取50 µl用于分析,。
牛奶樣本稀釋倍數(shù)：27    檢測下限：54ppb
5.3.2 奶粉樣本處理方法：
1）稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇,，充分振蕩,；
2）4000r/min離心10min，取100µl上清液,，再加入900µl復(fù)溶液,，混勻；
3）取50µl用于分析,。
奶粉樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：40ppb
5.3.3 牛奶/奶粉樣本處理方法二：
1）取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中,；
2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min,，取4ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥,；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液,，混合30s,，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50µl用于分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：2ppb
5.3.4 組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）樣本處理方法：   
1）取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中,；
2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min,，取2ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥,；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液,，混合30s,，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50µl用于分析,。
     樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：4ppb
5.3.5 飼料樣本處理方法：
1）將飼料樣品研碎,，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl,，加入16ml去離子水均質(zhì),；
2）旋流1min，放振蕩器上振蕩2min,；
3）4000r/min離心15min,，取出10ml上清液并用1M NaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼料樣品的不同,，加入1M NaOH的量有所差異,，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）
4）4000r/min 離心15min，吸出上清液（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）,；
5）取上清液用復(fù)溶液10倍稀釋（取100µl上清液加入900µl復(fù)溶液,，混合均勻）；
6）取50µl進(jìn)行分析,。
樣本稀釋倍數(shù)：100    檢測下限：200ppb
5.3.6 蛋類樣本處理方法：   
1）用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清,、蛋黃或全蛋）；
2）稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的樣本,，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,；（蛋清含蛋白成份高，加入提取液后會形成一團(tuán)膠狀物,，較蛋黃或全蛋難搖勻,，此情況為正常現(xiàn)象不影響實驗結(jié)果）
3）4000r/min離心10min,，取1ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥,；  
4）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液,，混合30s,，離心去除上層正己烷相；
5）取下層水相用復(fù)溶液4倍稀釋（50µl樣本液加150µl復(fù)溶液）,，混合30s,；
6）取50µl用于分析。
 樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：40ppb
5.3.7 血清樣本處理方法：   
1）取0.5ml血清樣本于50ml離心管中,；
2）加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,，4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥,；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s,，離心去除上層正己烷相,；
4）取下層水相50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：8ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,，將不用的微孔板放入自封袋,，保存于2-8℃。
實驗開始前,，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液,。
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,，再加入50µl/孔的抗體工作液,，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻,，25℃反應(yīng)30分鐘,。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干,，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次,，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl,，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻,，25℃避光顯色15分鐘,。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻,，終止反應(yīng),。
6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成,。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值,，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*,，在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中,，用蓋板膜封住微孔板,，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑,。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之,。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時,，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,，避免接觸皮膚,。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍,。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒。