本產(chǎn)品僅用于科研，不用于臨床

黃曲霉毒素總殘檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）

 
1 黃曲霉毒素總殘檢測試劑盒原理及用途
黃曲霉毒素是由黃曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,，主要污染玉米,、花生、堅(jiān)果等,。黃曲霉毒素以 AFB1,、AFB2、AFG1 和 AFG2 這四種毒素為主,，黃曲霉毒素總量一般是指這四種毒素的總量,。它們是 I 類致癌物，被證明對人和動(dòng)物的肝臟,、腎臟等組織和器官具有很大的危害,，是一類毒性很強(qiáng)的致癌物質(zhì)。
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測谷物,、花生,、飼料等樣品中的黃曲霉毒素，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板,、辣根酶標(biāo)記物,、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成,。檢測時(shí),，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,，樣本中的黃曲霉毒素和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗黃曲霉毒素抗體，加入酶標(biāo)記物后,，用TMB底物顯色,，樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素的殘留量,。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.02ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃,，30min～15min
2.3 檢測下限：
谷物……………………………………0.1ppb
配合飼料………………………………0.2ppb
食用油、花生…………………………0.2ppb
醬類,、麥類等飼料……………………0.2ppb
啤酒……………………………………0.2ppb
葡萄酒,、醬油、醋……………………0.1ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
黃曲霉毒素B1…………………………100%
黃曲霉毒素B2…………………………75%
黃曲霉毒素G1…………………………100%
黃曲霉毒素G2…………………………97%
黃曲霉毒素M1…………………………30%
 2.5 樣本回收率：
谷物及配合飼料……………………85%±15%
花生…………………………………82±15%
食用油………………………………85±15%
醬類,、麥類等飼料………………83±15%
啤酒………………………………84±15%
葡萄酒,、醬油、醋………………87±15%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml
0ppb,、0.02ppb、0.04ppb,、0.08ppb,、0.16ppb、0.32ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：100ppb…………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀,、打印機(jī),、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置,、振蕩器,、離心機(jī)、刻度移液管,、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl,，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：甲醇,、正己烷,、二氯甲烷 
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
5.2 配液：
配液1：樣本提取液
    70%甲醇,，即V甲醇:V去離子水=7：3。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 谷物處理方法 
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中,，加5ml樣品提取液,，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取0.5ml上清,，加入0.5ml去離子水,，混勻；
3）取50μl進(jìn)行分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.1ppb
5.3.2 配合飼料處理方法 
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中,，加10ml樣品提取液，振蕩5分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水,，混勻,；
3）取50μl進(jìn)行分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.2ppb
5.3.3 食用油,、花生,、高油脂的飼料處理方法
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加8ml正己烷和10ml樣品提取液,，振蕩5分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）去除上層液體,，取0.5ml下層液體加入0.5ml去離子水,，混勻；
3）取50μl進(jìn)行分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.2ppb
5.3.4 醬類,、麥類、餅干,、糕點(diǎn)等食品或調(diào)料,，以及飼料濃縮料等飼料處理方法
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml樣品提取液,，振蕩5分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取2ml上清,，加入4ml（或二氯甲烷）,，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
3）轉(zhuǎn)移上層液體到另一容器中,，下層液留置備用，向上層液中再加入4ml（或二氯甲烷）,，充分振蕩混5分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
4）去除上層液體，合并兩次的下層液體并充分混勻,；
5）取合并后的下層液體2ml于50-60℃氮?dú)庀麓蹈桑?br />6）加入0.5ml樣品提取液充分溶解干燥物,，再加入0.5ml去離子水混勻；
7）取50μl進(jìn)行分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.2ppb
5.3.5 啤酒處理方法
1）將啤酒充分?jǐn)嚢瑁ㄈコ鼵O2）,，取2ml啤酒樣品，加入1ml蒸餾水,，再加入7ml甲醇,，振蕩5分鐘；
2）取混勻后的樣品液0.5ml加入0.5ml去離子水,，混勻,；
3）取50μl進(jìn)行分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.2ppb
5.3.6 葡萄酒,、醬油,、醋處理方法
1）取2ml樣品，加入2ml蒸餾水,，再加入10ml（或二氯甲烷）,，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取下層液體1ml于50-60℃氮?dú)庀麓蹈桑?br />3）加入0.5ml樣品提取液充分溶解干燥物,，再加入0.5ml去離子水，混勻,；
5）取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.1ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,，將不用的微孔板放入自封袋,，保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開始前,，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液,。
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,，再加入50µl/孔的抗體工作液,，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘,。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜,，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次,，每次間隔30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl,，再加底物液B 50µl,，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘,。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl,，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng),。
6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）,。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值,，再乘以100%,，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度,。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析,。（索取）
8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。
8.3 混合要均勻，洗板要*,，在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中,，用蓋板膜封住微孔板,，避免光線照射,。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑,。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí),，表示試劑可能變質(zhì),。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚,。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒,。