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當(dāng)前位置:研域(上海)化學(xué)試劑有限公司>>技術(shù)文章>>細(xì)胞凋亡的幾種檢測(cè)方法
一,、形態(tài)學(xué)觀察方法
1,、HE染色、光鏡觀察:凋亡細(xì)胞呈圓形,,胞核深染,,胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)成團(tuán)塊狀,,細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象,。
2、丫啶橙(AO)染色,,熒光顯微鏡觀察:活細(xì)胞核呈黃綠色熒光,,胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),,可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體,。
3、臺(tái)盼藍(lán)染色:如果細(xì)胞膜不完整,、破裂,,臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞變藍(lán),,即為壞死,。如果細(xì)胞膜完整,細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色,,則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞,。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性,區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助,。
4,、透射電鏡觀察:可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮,、邊集,,常呈新月形,核膜皺褶,,胞質(zhì)緊實(shí),細(xì)胞器集中,,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象,。
二、DNA凝膠電泳
(一),、檢測(cè)原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死,,其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂,,細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加,高分子DNA減少,,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷,。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,出現(xiàn)180-200bpDNA片斷,,而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷,,利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡,并可與壞死細(xì)胞區(qū)別,。
(二)結(jié)果判斷
正?;罴?xì)胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀(LADDER)條帶;壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶,。
三,、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測(cè)定
凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成,,可由ELISA法檢測(cè),。
(一)檢測(cè)步驟
1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心,,其上清液中含有核小體,;
2、在微定量板上吸附組蛋白體’
3,、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合‘
4,、加辣過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合’
4、加酶的底物,,測(cè)光吸收制,。
(二)用途
該法敏感性高,可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞,??捎糜谌恕⒋笫?、小鼠的凋亡檢測(cè),。該法不需要特殊儀器,適合基層工作,,但是不能測(cè)定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕多對(duì)量,。
四、流式細(xì)胞儀定量分析
(一)檢測(cè)原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),,其細(xì)胞膜的通透性也增加,,但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn),,被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色,,利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞,、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。
(二)應(yīng)用價(jià)值
流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有以下特點(diǎn):
1),、檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量大,,因此其反映群體細(xì)胞的凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確
2)、可以做許多相關(guān)性分析
3),、結(jié)合被檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量的分析,,可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期
■檢測(cè)形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),其細(xì)胞膜的通透性液增加,,但其程度介于正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞之間,,利用這一特點(diǎn),被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色,,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞,、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。
利用Hoechs-PI染色法,,正常細(xì)胞對(duì)染料有抗拒性,,熒光染色很淺,凋亡細(xì)胞主要攝取Hoecha染料,,呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光,,而壞死細(xì)胞主要攝取碘化丙啶(PI)而呈強(qiáng)的紅色熒光。
■DNA片斷原位標(biāo)記法
凋亡細(xì)胞DNA片斷原位末端檢測(cè)技術(shù)是指在細(xì)胞(或組織)結(jié)構(gòu)保持不變的情況下,,用熒光素,、地高辛或生物素標(biāo)記的脫氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)相反應(yīng)與凋亡細(xì)胞裂解后3·的羥基(-OH)端結(jié)合,,經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測(cè)DNA裂解點(diǎn)的技術(shù),。
DNA片段原位標(biāo)記法有二種:
1、原位缺口轉(zhuǎn)移(in situ nick-translation,ISNT)技術(shù),,它是利用DNA多聚酶I將標(biāo)記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·-OH端
2,、原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)(in situ end labelling technique,ISEL),即TUNEL法,,它是利用TdT將標(biāo)記的DUPT接到3·-OH端,。研究證明,TUNEL法的敏感性遠(yuǎn)高于ISNT,,尤其對(duì)早期凋亡的檢測(cè),,TUNEL更為合適。
■檢測(cè)細(xì)胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法
1,、原理:在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至細(xì)胞膜外測(cè),。磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,它于PS具有高度的結(jié)合力。因此,,Annexin V可以作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞外測(cè)的磷脂酰絲氨酸。故利用對(duì)PS有高度親和力的Annexin V,,將Annexin V標(biāo)記上熒光素(如異硫氰酸熒光素FITC),,同時(shí)結(jié)合使用PI拒染法(因壞死細(xì)胞PS亦暴露于細(xì)胞膜外測(cè),且對(duì)PI高染)進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染法后用流式細(xì)胞儀即可檢測(cè)凋亡細(xì)胞,。
2,、結(jié)果判斷:正常活細(xì)胞Annexin V ,、PI均低染,;凋亡細(xì)胞Annexin V高染、PI低染,;壞死細(xì)胞Annexin V/PI均高染,。
3、應(yīng)用價(jià)值:細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),,膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生,,因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞,,可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失,。因此,Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí),,結(jié)果更為可靠,,是目前zui為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。
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