采血

（一）材料與試劑

1．抗凝劑
（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖,，常用其鈉鹽或鉀鹽,，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶,，進(jìn)而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白,，從而阻止血液凝固,。常用的肝素溶液濃度為1 000U/ml,，市售肝素多為100U~126U／mg。
（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一種螯合劑,。用生理鹽水配制成4％的溶液備用,。
（3）阿氏液（Alsever液），配方如下：
枸櫞酸鈉（Na3C6H5O7·5H2O） 0.80g
枸櫞酸 0.0325g
葡萄糖 2.05g
氯化鈉 0.42g
H2O 加至 100.00ml
混勻溶解后,，114.3℃高壓蒸汽滅菌10min備用,。
阿氏液中既含有枸櫞酸鈉抗凝劑，又含有細(xì)胞生存的營養(yǎng),，所以它既可做抗凝劑,，又可做血細(xì)胞的保存液。
2．針頭 根據(jù)不同動物和采血部位,，采用不同型號的針頭,，用前必須滅菌或消毒。
3．采血容器 注射器或三角瓶等,。
4．采血動物,。

（二）操作方法
1．采血法 各種動物采血方法不一。馬,、牛,、羊等大動物一般從頸靜脈采血,，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血,，家禽由翼下靜脈或心臟采血,，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血,，豚鼠由心臟采血,，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。
2．抗凝 采集血液zui關(guān)鍵的問題是抗凝,，采用什么方法進(jìn)行抗凝,，則根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求和條件而定。zui常用的方法如下：
（1）肝素抗凝：采血時,，使每ml血液含15U~20U肝素即可,。計算采集的血液量，按1 000U/ml的量加入肝素,，直接放入采血容器中,，采血時，邊采血邊輕輕搖動,，使抗凝劑和血液混勻,。對于采少量的血液或小動物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液,，再采血直接抗凝,。
（2）EDTA抗凝：采血前，用滅菌生理鹽水將EDTA配制成4％溶液,，然后按預(yù)采血液的量,，以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液體量于采血容器內(nèi)。采血,，并不斷搖動采血容器,，使之混勻。
（3）玻璃珠法：預(yù)先將適量的玻璃珠（根據(jù)采血量多少而定）清洗后,，裝入采血容器中,，滅菌后備用。采血過程中,，邊采邊搖采血瓶,，以使小玻璃珠在血液中滾動，以機(jī)械地除去纖維蛋白,，使血液不能凝固,。本法雖較麻煩，但對淋巴細(xì)胞的活性影響zui小，且可減少血小板的混雜,。
（4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液,，邊采邊輕輕搖動采血瓶，使之混勻,。用阿氏液采血,，除了抗凝外，多用于紅細(xì)胞的保存,。一般在4℃條件下,，阿氏液中保存的紅細(xì)胞2周其活性和特性不變。

紅細(xì)胞的分離技術(shù)

（一）材料與試劑

1．肝素等抗凝劑
2．3％明膠液 取明膠3g,，溶于0.9％滅菌鹽水100ml中,，114.3℃滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存,。臨用時,，37℃預(yù)熱10min。
3．阿氏液

（二）操作方法
1．采血抗凝,，即為紅細(xì)胞,。由于紅細(xì)胞與白細(xì)胞的比例相差懸殊，一般白細(xì)胞混雜在其中,，忽略不計,。
2．根據(jù)紅細(xì)胞的用途，可做進(jìn)一步的處理,。如計算紅細(xì)胞,，可直接稀釋計數(shù),。如需做補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng),，或其它溶紅細(xì)胞反應(yīng)，則需將紅細(xì)胞進(jìn)行充分的清洗,，以除去附著在紅細(xì)胞膜表面的血漿,。一般用等滲的稀釋液連續(xù)清洗，2 000r/min離心10min,，重復(fù)3~4次。
3．如需儲藏備用,，則以阿氏液做抗凝劑采血,，混勻后置4℃冰箱保存，可保存2周,，其活性尚可,。

淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)

（一）材料與試劑
1．淋巴細(xì)胞分層液有兩種：
（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000,，多配制成40±1％（W/V）水溶液,，也有干粉出售,。應(yīng)用時，用蒸餾水配制9％溶液,。泛影葡胺溶液（Meglumini diatrizoici）,，商品名Vrografin，結(jié)構(gòu)式為3,，5—二乙酰氨基2,，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇,。含量為60％或75％,，每安瓶為20ml裝，常用于人的臟器造影,。應(yīng)用時,，取60％泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15.38ml,，即為33.9％泛影葡胺,。

1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：
9％聚蔗糖液 24份
33.9％泛影葡胺液 10份
混合即可。必要時,，可測比重,。需要備用，可用G5漏斗過濾除菌或114.3℃高壓滅菌15min,，4℃保存,。一般可保存3個月。
如要配制不同比例的分層液,，可按下列公式計算：
式中dm為分層液的比重，d1和d2分別為9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重,，V1和V2分別為它們的體積,。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分層液，則9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例應(yīng)為100︰46.3,。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液
34％泛影葡胺液 10份
60％右旋糖酐液 12.5份
混合,，即為比重1.07～1.09的分層液,。分裝于棕色瓶中,，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
2． 3％的明膠液 稱取明膠3g，溶于0.9％的滅菌生理鹽水,，終體積100ml，114.3℃高壓滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存,，臨用時37℃預(yù)熱10min。

3．Hank’s液,。
（二）操作方法
1．取抗凝血,，自然沉降，如是馬屬動物的血液,，可直接直立試管架上，讓其自然沉降1h,，取上層血漿,。如是牛、羊血液,，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明膠液,，混勻后讓其自然沉降,，1h后取上層血漿。
2．2 000r/min離心10min,，棄上清,。
3．沉淀用Hank’s液混懸后，再2 000r/min離心10min,。
4．重復(fù)步驟3一次,，再用細(xì)胞營養(yǎng)液將白細(xì)胞制成懸液。此液含有整個白細(xì)胞群,，包括粒細(xì)胞,、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分紅細(xì)胞,?？晒┌准?xì)胞計數(shù)用。
5．取2ml細(xì)胞分層液于離心管內(nèi),，同時用毛細(xì)吸管吸取約2ml的血漿（自然沉降1h的上層血漿）輕輕加入分層液上，直接加抗凝血也可,。
6．以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2 000r/min離心20min,。離心后,，可見分成多層,，zui下層是紅細(xì)胞，中間層是分層液，zui上層是血漿,。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層,，即為單個核細(xì)胞層。
7．用毛細(xì)吸管插入到單個核細(xì)胞層并吸取該層,，放入另一試管中,。
8．以Hank’s液洗滌、離心,，zui后配制成適當(dāng)?shù)陌准?xì)胞濃度,。必要時可計數(shù)。

（三）注意事項(xiàng)
1．血漿或血液加入分層液中時要小心,，緩慢不要打亂液層,、不要搖動。也可以將分層液加入到血漿的上層,。
2．保持淋巴細(xì)胞的活性是非常重要的,，所以一般情況下，是現(xiàn)采血,，馬上進(jìn)行分離,。
3．經(jīng)過分層液分離的淋巴細(xì)胞層，實(shí)際上是單個核細(xì)胞層,，包括單核細(xì)胞,，不包括粒細(xì)胞。欲分離出純的淋巴細(xì)胞,，則按下法除去單核細(xì)胞,，或收獲單核細(xì)胞。

T淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)

（一）原理
混合單個核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時,，B細(xì)胞,、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上,，而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱,，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。

（二）材料及試劑
1．尼龍毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）,。
2．燒杯,、鋁箔、漏斗,、一次性手套等,。
3．裝填尼龍毛柱，一次性注射器,。
4．取自然沉降的上層血漿,，過聚蔗糖—泛影葡胺分層液后,，獲取的血漿和分層液之間的單個核細(xì)胞層。

（三）操作方法
1．尼龍毛的清洗與干燥
（1）戴上已經(jīng)洗去滑石粉的一次性手套,，將尼龍毛（1包或2包,，每包35g）放入燒杯中，加入蒸餾水或去離子水,，用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min,。
（2）冷卻至常溫，倒入漏斗內(nèi),，使水滴干,。
（3）重復(fù)（1）、（2）步驟6次,。
（4）將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內(nèi),，37℃溫箱干燥2～3天后，貯藏在帶蓋的方盤內(nèi),。

2．裝尼龍毛柱
（1）取50ml玻璃注射器,，拔去注射芯，在注射器頭上套一段帶夾子的膠管,。
（2）將尼龍毛梳理,，并適當(dāng)折疊，以適應(yīng)注射器的直徑,，填入注射器內(nèi),，約20ml的體積。
（3）將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好,，高壓滅菌,。

3．細(xì)胞分離
（1）將注射器固定在支架上，倒入37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液,，關(guān)閉閥門一定時間,，然后打開閥門，放掉細(xì)胞培養(yǎng)液,，以清洗幾次尼龍毛,，關(guān)上閥門。
（2）將要分離的細(xì)胞液用預(yù)先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，約5.00×107個細(xì)胞／ml,。
（3）將細(xì)胞液倒入注射器內(nèi)，使之沒過尼龍毛柱,。蓋上注射器,，37℃溫育45min
至1h。
（4）打開下口,，緩慢放流（1滴／min）,，收集于離心管中。
（5）離心,，即獲所需的T淋巴細(xì)胞,。
（6）關(guān)閉注射器下口，于注射器內(nèi)加入0.85％冰冷生理鹽水,，振蕩,，并套上注射器芯，打開下口,，使勁推出注射器內(nèi)液體,，即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞,、巨噬細(xì)胞等,。
（四）注意事項(xiàng)
1．此種分離法，T淋巴細(xì)胞也常有一部分被吸附,，吸附的多少與尼龍毛的質(zhì)量有關(guān),，與裝柱的松緊也有關(guān)系。
2．此法的T淋巴細(xì)胞的回收率約20％～30％,。
3．用過的尼龍毛可回收,，以鹽水洗滌，然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜,，然后再同前法清洗,。

單核細(xì)胞分離技術(shù)

（一）鐵粉吸附法
1．材料及試劑
（1）鐵粉或羰基鐵粉（Atomergic chemetals）99％的純度，顆粒小于60µm（Goodfellow Metals）,。
（2）強(qiáng)磁鐵（馬蹄形）,。
（3）一塊小棒狀磁鐵（約1cm長）。
（4）毛細(xì)吸管等,。
2．操作方法
（1）稱取一定量的鐵粉,，一般為10g，用100ml生理鹽水洗滌4次,，去除任何可溶性有毒物質(zhì),。在倒去鹽水時，用強(qiáng)磁鐵吸住鐵粉,。
（2）用50ml生理鹽水混懸鐵粉,。搖勻后，分裝于10個瓶中,，包扎瓶口,，121℃滅菌20min，拿出后立即輕輕搖勻,，防止鐵粉結(jié)塊,，儲藏備用,。
（3）臨用前，倒去瓶中的生理鹽水,，加入適量的單個核細(xì)胞懸液（3ml～5ml,，細(xì)胞總數(shù)為8×107個／瓶）。37℃溫育45min,，中間不時晃動,，使鐵粉懸浮起來。
（4）加入一塊小磁鐵棒于瓶中,，讓其吸住鐵粉以及附著在鐵粉上的細(xì)胞,。
（5）倒出懸液，此懸液主要是淋巴細(xì)胞,，離心,，收集。
（6）在鐵粉瓶內(nèi)倒入一定量的Hank’s液,，用力振搖后,，以強(qiáng)磁鐵吸附，幾分鐘后,，倒出液體,。
（7）2 000r/min離心液體，管底即為單核細(xì)胞,。

（二）玻璃板吸附法
將分離的單個核細(xì)胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi),，置37℃ 30 min～40min，用毛細(xì)吸管輕輕吸取懸液,，即為淋巴細(xì)胞,。用適量的Hank’s液沖洗平皿，收獲即為單核細(xì)胞懸液,。