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流式抗體的選擇使用及注意事項

時間:2021/10/28閱讀:5531
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流式抗體的選擇:


1、流式抗體本身也是抗體,,所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇基本的條件:目標蛋白特異性,反應種屬以及應用實驗,。

2,、流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中,,盡量減少實驗工序和過程,,以保證實驗的真實和準確性。因此在條件允許的范圍內(nèi),,建議盡量用直接標記的抗體進行實驗而不去做間接標記,。


3、流式抗體熒光標記的選擇:如果實驗中檢測單一指標:不同熒光標記在不同的儀器上強度不同,。FACS Calibur儀器為例:PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5,,通常來說,PE*,,適用于弱表達抗原,。FITC強度較弱,適用于強表達抗原,,使用范圍比較廣,。用戶需根據(jù)檢測的目標蛋白進行具體選擇。如果同時檢測多個指標:確認流式細胞儀能檢測多少個通道:流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素,。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配,。如:實驗者同時檢測三個指標,可以在圖1中綠色,、和紅色三個通道中各選一個適當?shù)臒晒馑貥擞?,F(xiàn)ITC、PE和PE-cy5,。切忌所有指標選擇同一個通道的熒光標記,,以防止熒光的重疊和相互干擾,影響后結(jié)果,。因此,,流式細胞儀的通道越多,,同一份樣本能同時做的表面/胞內(nèi)標志就越多。常用熒光標記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等,。

抗體

同型對照的選擇:
流式細胞實驗和其他抗體相關(guān)實驗有點不同的就是需要選擇同型對照,。同型對照,是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色,,相當于實驗的陰性對照,。同型對照選擇與標記抗體同種屬來源,同亞型,,同熒光標記的抗體,。比如:抗人的CD3的PE標記的抗體,小鼠的IgG2a,。同型對照選擇PE標記的小鼠的IgG2a,。

流式抗體的選擇使用注意事項:


1、建議實驗細胞的數(shù)量和抗體的比例要適當,。細胞過量或抗體過量都可能使實驗結(jié)果受影響,,因此需要優(yōu)化試驗條件。注:不同的流式技術(shù)對抗體的需求量有較大差異,,例如傳統(tǒng)流式細胞術(shù)(采用鞘液流系統(tǒng))需要1×106個細胞為起始上樣量,,抗體用量為10μl,而微流式細胞術(shù)則只需5×105個細胞,,抗體用量減少到5μl,。


2、 直標的流式抗體應該4℃避光保存,,不要冷凍,。


3、 盡量選擇經(jīng)實驗驗證的流式抗體,,以保證實驗結(jié)果,。

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