徠卡顯微系統(tǒng) 應(yīng)用專家 肖麗國
2020年,，似乎來得更艱難一點(diǎn)。從去年12月份開始,，疫情就像龍卷風(fēng)一樣席卷,，當(dāng)前已在217個(gè)國家地區(qū)蔓延,，確診超2402萬例,，死亡破82萬例,。疫情構(gòu)成大流行的威脅“已經(jīng)變得非常真實(shí)”,。
WHO Coronavirus Disease Overview
數(shù)據(jù)來源：World Health Organization,，Date by 2:44pm CEST, 27 August 2020
疫情之下,，奔跑在一線的有我們的白衣天使,，也有爭分奪秒的科研人員。而在整個(gè)疫情的防控防治過程中,，電鏡技術(shù),，讓病毒無所遁形,。
負(fù)染色技術(shù)—鑒定病毒形態(tài)
為什么是冠狀病毒,？
電鏡給了一個(gè)很重要的指標(biāo)：病毒形態(tài)。
1月6日,，中國疾病預(yù)防控制中心通過對(duì)臨床患者分離毒株樣品進(jìn)行電鏡負(fù)染色,，發(fā)現(xiàn)了病毒的存在,，且形狀與冠狀病毒相似，直徑80-120nm,，表面有皇冠一樣的突起,，這就給我們一個(gè)很重要的方向指示,。隨后,，根據(jù)核酸序列比對(duì)以及其他鑒定方法,，宣布疫情病毒肺炎疫情爆發(fā),。
圖片來源：中國疾病預(yù)防控制中心
負(fù)染色技術(shù)可以鑒別病毒形態(tài)、純度和濃度
負(fù)染技術(shù)流程簡單,，檢測速度快,。一般幾分鐘就可以完成。
載網(wǎng)要求：
1,、載網(wǎng)親水：商業(yè)化載網(wǎng)表面有油脂,，懸液樣品鋪不開
2,、碳膜載網(wǎng)：促進(jìn)樣品顆粒均勻分布
徠卡高真空鍍膜儀，一機(jī)兩用：鍍膜+輝光放電
EM ACE系列鍍膜儀（Leica EM ACE200）
負(fù)染技術(shù)—徠卡解決方案
冷凍電鏡技術(shù)—指導(dǎo)藥物和疫苗設(shè)計(jì)
疫情病毒表面的S蛋白,，是侵染宿主的關(guān)鍵蛋白,，與SARS病毒S蛋白一樣，都將宿主細(xì)胞表面的“血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）”作為侵入細(xì)胞的關(guān)鍵受體,。了解S蛋白的結(jié)構(gòu),，弄清楚S蛋白與ACE2的作用方式，是藥物開發(fā)和疫苗設(shè)計(jì)的重點(diǎn),。
2月15日,，德克薩斯大學(xué)*分校McLellan團(tuán)隊(duì)獲得了疫情病毒S蛋白三維結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)3.5埃,，確定了該S蛋白是由S1和S2組成的三聚體,。RBD是受體結(jié)合區(qū)域,，存在多種構(gòu)象狀態(tài),。與SARS病毒S蛋白比較,，兩者是不同的,，但整體上仍具有較高的相似度,。
隨后,，作者又分別分析了兩個(gè)病毒S蛋白與ACE2的親和力,，疫情病毒S蛋白與ACE2的KD（平衡解離常數(shù)）是14.7nM，SARS病毒S蛋白與ACE2的KD是324.8nM,，KD越高，親和力越低，暗示著疫情病毒的傳染性要高于SARS病毒,。
3月1日,，華盛頓大學(xué)David Veesler團(tuán)隊(duì)根據(jù)S蛋白存在多種構(gòu)象,，重構(gòu)了3.0埃的close構(gòu)象，以及3.3埃的打開單個(gè)SB區(qū)的三聚體,。
結(jié)果表明,，疫情病毒S胞外區(qū)表現(xiàn)為一個(gè)16nm長的三聚體,，三角形截面,，與SARS病毒S蛋白非常相似。很多序列是保守的,，設(shè)計(jì)針對(duì)這一結(jié)構(gòu)功能的抗體，可能會(huì)交叉反應(yīng)中和這兩種病毒以及其他相似的冠狀病毒,。
同時(shí)還發(fā)現(xiàn)S1和S2邊界處存在四個(gè)氨基酸殘基插入，從而引入了新的蛋白酶切位點(diǎn)。這就可能會(huì)增強(qiáng)病毒的可傳播性,，更加科學(xué)地解釋了疫情病毒傳染力強(qiáng)的問題,。
2月19日,，西湖大學(xué)周強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)獲得了ACE2的全長三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)解析了S蛋白R(shí)BD和ACE2的復(fù)合物三維結(jié)構(gòu),，看清楚了它們的相互作用方式,，這一步正式揭開了疫情病毒入侵人體細(xì)胞的神秘面紗,。
“S蛋白像一座橋橫跨在ACE2表面，又像病毒的一只手,，緊緊抓住ACE2,，打開細(xì)胞大門”,。
了解了鎖的結(jié)構(gòu)，接下來,，就可以有針對(duì)性地設(shè)計(jì)鑰匙,，設(shè)計(jì)藥物和指導(dǎo)疫苗的研發(fā)。技術(shù)流程與負(fù)染類似,，但是樣品終要經(jīng)過投入冷凍,，在低溫電鏡下進(jìn)行觀察。
徠卡的EM GP2,，就是一款專業(yè)的投入冷凍儀,，通過對(duì)樣品的單邊或雙邊的平行吸附，實(shí)現(xiàn)樣品的快速均勻冷凍,。包括生物樣品,，工業(yè)溶劑、懸濁液,、乳濁液,、膠體樣品等。
冷凍電鏡技術(shù)—徠卡解決方案
結(jié)果展示：
樣品：蛋白
觀察方式：cryo TEM
樣品：病毒
觀察方式：cryo TEM
樣品：纖維
觀察方式：cryo TEM
樣品：細(xì)菌
觀察方式：cryo TEM
電鏡是微生物研究中*的工具,，病原體的確定毋庸置疑在傳染病防控中占有地位,，而電鏡檢查是確定病毒顆粒的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡研究,，制樣先行,。如果您想了解更多關(guān)于電鏡制樣與病原體研究的內(nèi)容，請(qǐng)與我們聯(lián)系吧,！
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