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徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易...

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利用徠卡THUNDER成像系統(tǒng)探索微生物腸道免疫機(jī)制

閱讀:1264      發(fā)布時(shí)間:2020-8-24
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由SARS-CoV-2冠狀病毒引起的疫情影響了世界的方方面面。免疫和治療方法等抗病毒方向的研究在2020年具有高優(yōu)先級(jí),,顯微鏡在這類研究中起著舉足輕重的作用,。了解受體結(jié)合、基因組釋放、復(fù)制,、組裝和病毒出芽的基本原理及免疫應(yīng)答,,可以使用不同的方法和顯微鏡。鑒于顯微鏡在感染生物學(xué)中的重要作用,,我們舉例闡述不同的顯微技術(shù)及其在這些研究領(lǐng)域中的應(yīng)用,。

 

研究背景

人類出生后胃腸道立刻被復(fù)雜的微生物群落定植(1000余種,且數(shù)量>100萬(wàn)億),,而這些腸道微生物群落影響宿主生理的多個(gè)方面,,包括代謝、免疫反應(yīng),、行為和晝夜節(jié)律等等,。先前的研究認(rèn)為腸道微生物群落主要是共生菌,共生菌可控制病原菌數(shù)量,,而黏膜屏障免疫對(duì)于維持共生菌群和抵抗侵入性細(xì)菌感染至關(guān)重要,。

微生物-腸-腦軸是將大腦和腸道功能整合的雙向信息交流系統(tǒng),并涉及神經(jīng),、免疫和內(nèi)分泌機(jī)制,。除了神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)免疫系統(tǒng)之外,該軸還包括了中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)的交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)分支以及腸道神經(jīng)系統(tǒng)(ENS),。從腸道到CNS的傳入纖維(如大腦、扣帶回,、小腦扁桃體和扁桃體皮質(zhì))以及腸道平滑肌的效應(yīng)纖維是沿著微生物-腸-腦軸進(jìn)行雙向信息交流的主要途徑,。

微生物--腦軸

 

腸道神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)遍布腸道組織的每個(gè)角落,將收集到的信息迅速地傳遞到自體或非自體類型的細(xì)胞,,織就一個(gè)龐大又復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),。新涌現(xiàn)的多個(gè)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)ENS可以作為免疫系統(tǒng)的感應(yīng)平臺(tái),但對(duì)ENS與上皮細(xì)胞的互作機(jī)制還知之甚少,。

 

2019年12月,,Jarret等人在Cell發(fā)表了題為Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity的文章。借助單分子mRNA熒光原位雜交(smFISH; THUNDER Imager 3D Live Cell),,研究發(fā)現(xiàn)ENS神經(jīng)元分泌IL-18作用于腸道上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞,,促進(jìn)杯狀細(xì)胞抗菌蛋白(AMP)的表達(dá),在腸道免疫中起著重要作用,。

 2 ENS與腸道上皮細(xì)胞互作機(jī)制

 

研究過(guò)程

鑒于大腦中神經(jīng)元會(huì)分泌IL-18,,而大量研究表明ENS可能在調(diào)節(jié)粘膜屏障免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用,因此研究人員大膽猜測(cè)腸道神經(jīng)元也會(huì)分泌IL-18,。接下來(lái)作者構(gòu)建ENS特異性敲除IL-18小鼠和多種細(xì)胞類型特異性敲除IL-18R小鼠,,并分別用鼠傷寒沙門氏菌(S.t)感染,。之后作者通過(guò)共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)不攜帶ENS所產(chǎn)生的IL-18的小鼠則更容易受到感染。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn),,研究人員使用了IL18 mRNA探針在小鼠中進(jìn)行了單分子mRNA熒光原位雜交(smFISH),,結(jié)果顯示在IL-18-/-小鼠結(jié)腸中IL18 mRNA探針的信號(hào)丟失。

3 THUNDER驗(yàn)證結(jié)果與Confocal觀察結(jié)果一致

A)用于分析IL-18+神經(jīng)元的Confocal正交視圖,。IL-18(紅色),,Tubb3(綠色)。
B)通過(guò)smFISH觀察野生型與IL18-/-小鼠結(jié)腸中的IL18 mRNA(白色)和DAPI(藍(lán)色),。

 

同時(shí)通過(guò)smFISH檢測(cè)小鼠腸組織中IL18與Tubb3的表達(dá),,觀察到IL18 mRNA探針與神經(jīng)元特異性Tubb3 mRNA探針共定位。

4 smFISH檢測(cè)小鼠腸組織中IL18(紅色),、Tubb3(白色)表達(dá),;DAPI(藍(lán)色)表示細(xì)胞核

 

總之,這些數(shù)據(jù)表明腸神經(jīng)元是結(jié)腸中IL-18的新產(chǎn)生者,。研究還結(jié)合了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)來(lái)探究ENS來(lái)源IL-18的功能以及作用方式,。

 

實(shí)驗(yàn)方法

  1. 處死小鼠,移出結(jié)腸并用冷PBS沖洗,??v向剖開結(jié)腸組織平鋪于濾紙。
  2. 用4%多聚甲醛PBS溶液固定3小時(shí),,后置于30%蔗糖,、4%PFA的PBS溶液中4℃過(guò)夜。
  3. 包埋,,制成將7mm厚切片,并用于smFISH染色,。
  4. 設(shè)計(jì)的探針庫(kù)與Cy5(IL-18),、TMR(Tubb3)結(jié)合,將切片與smFISH探針庫(kù)雜交,。
  5. 封片前去除ENS內(nèi)的自發(fā)熒光信號(hào),。
  6. 在Leica THUNDER Imager 3D Live Cell上進(jìn)行smFISH成像,使用自帶的THUNDER Computational Clearing設(shè)置,。

 

看到這里大家可能會(huì)有一個(gè)疑問(wèn):為什么不用共聚焦做smFISH而是選擇徠卡THUNDER,?對(duì),為什么,?小編也提出過(guò)這個(gè)問(wèn)題,,但是下面這段話做出了很好地解釋。

 

smFISH的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中探針會(huì)發(fā)出大量光子,,而共聚焦則會(huì)顯著限制光子收集的數(shù)量,,為了大限度回收這些光子,,更建議使用寬場(chǎng)技術(shù)。

 

徠卡THUNDER憑借其高分辨,、快速,、大視野的特點(diǎn),可大限度回收實(shí)驗(yàn)中smFISH探針發(fā)出的大量光子,,減少光損耗,,更適用于smFISH成像。不僅可以獲得清晰銳利的圖像,,實(shí)驗(yàn)結(jié)果更便于統(tǒng)計(jì)分析且重復(fù)性高,,是您進(jìn)行組織大視野快掃的*。

 

參考文獻(xiàn)

  1. Jarret et al., 2020, Cell 180, 50–63
  2. Brain Res. 2018 August 15; 1693(Pt B): 128–133
  3. Jung, Y. J.,et al., 2017, Sci Rep 7(1):17360
  4. Zhang, H., et al. 2018, Synth Syst Biotechnol 3(2): 113-120

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