治療性寡核苷酸的純化及表征是目前制藥行業(yè)的一大熱點,。然而,，寡核苷酸的表征，特別是通過離子對反相液相色譜（IP-RPLC）進行表征,，可能會非常具有挑戰(zhàn)性,。治療性寡核苷酸是通過固相合成制造，也就是核苷酸以特定合成步驟進行循環(huán),。因此,，我們必須對 n-1 和 n+1 等雜質(zhì)進行表征，這其中可能需要大量的方法開發(fā)步驟來進行優(yōu)化。此外,，我們可能還需要對其他密切相關的雜質(zhì)進行表征和定量,，例如硫代磷酸酯的氧化。
另一個挑戰(zhàn)是在寡核苷酸分析中可能會觀察到的色譜的變化,。保留時間,、峰形和峰面積回收率可能在一個序列的進樣之間變化。這些變化的一個可能原因是有會影響色譜性能的分子內(nèi)相互作用,。因此,，我們通常會采用超過 60°C 的高溫來改善分離。雖然這是處理雙鏈寡核苷酸（如 siRNA）時的基本要求,，但單鏈寡核苷酸是否也有必要在高溫下分析是一個值得討論的問題,。在此技術筆記中，我們展示了溫度對兩種寡核苷酸,，一種 5‘ 共軛寡核苷酸和一種硫代磷酸酯,，的影響，以及如何將其用于單鏈寡核苷酸的方法開發(fā)過程,。
圖 1 說明了以 5°C 為增量增加方法運行溫度的效果,。和其他色譜方法類似， 5'-氨基 C12 寡核苷酸的保留時間隨著溫度升高而減少,。通常,，效率和峰形在更高的溫度下會得到改善，但是在本示例中沒有觀察到這一點,。此外,，在比較 45°C 和 65°C 的雜質(zhì)分布時，圖中幾乎沒有顯示出明顯差異,。因此,，人們可能會得出結論，選擇性沒有受到溫度的影響,。
為了更好地確認選擇性變化,，需要使用質(zhì)譜來識別和表征雜質(zhì)峰。具有未知序列的 22 mer DNA 硫代磷酸酯通過高分辨率 MS 進行分析,。硫代酸鹽的測量質(zhì)量為 6772.6 Da,。我們在不同溫度下進行寡核苷酸的分析，以觀察雜質(zhì)分析選擇性的變化,。
在比較 60 和 70°C 下運行的方法時（圖 2）,，如預期所示，在較高運行溫度下,，主峰的保留顯著降低,。然而,，兩種方法都給出了相似的雜質(zhì)譜。我們觀察到了三種較早洗脫的雜質(zhì),。解卷積質(zhì)譜證實了相同的洗脫順序,。雜質(zhì)峰1為6443.4 Da，峰2為6468.4 Da,，峰3為6170.8 Da。兩種運行條件下峰 1 的解卷積光譜如圖 3 所示,。有趣的是,，峰 1 和 2 可能都是 n-1 雜質(zhì)，峰 1 是目標序列減去鳥苷,，峰 2 是目標序列減去胸苷,。
總的來說
不同溫度通常用于寡核苷酸分析的方法開發(fā)。然而,，對于單鏈寡核苷酸,，在超過 60 的溫度下運行可能并沒有太大提升。因為溫度的升高可能不會改善色譜分離,，也不會影響選擇性,，正如我們在其他大分子中觀察到的一樣。
液相色譜條件
色譜柱： bioZen™ 2.6 µm Oligo
規(guī)格： 100 x 2.1 mm （圖 1）00D-4790-AN
150 x 2.1 mm （圖 2,3）00F-4790-AN
流動相：圖1：
A：12.5 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液
B：12.5 mM HFIP, 4 mM TEA甲醇溶液
圖2,，3：
A：100 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液
B：100 mM HFIP, 4 mM TEA 甲醇溶液
梯度： 5-30 % B 于14分鐘內(nèi) （圖1）
25-95% B于15分鐘內(nèi)（圖2,，3）
流速： 0.3 mL/min
進樣量： 1uL
溫度： 如圖所示
檢測器： UV@260nm（圖1，2）
TOF-MS（圖3）
樣品： 5‘-氨基C12 寡核苷酸（圖1）
DNA 22mer硫代磷酸酯（圖2,，3）
圖1：溫度對 5'-氨基 C12 寡核苷酸的影響
圖2：22 mer DNA 硫代磷酸酯的雜質(zhì)譜圖
圖3：雜質(zhì)峰 1 的解卷積譜圖
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