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原核注射實(shí)驗(yàn)
- 公司名稱 上海達(dá)為科生物科技有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號(hào)
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時(shí)間 2025/7/10 13:24:53
- 訪問次數(shù) 28
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制作動(dòng)物模型 細(xì)胞培養(yǎng) 分子生物學(xué)檢測(cè) 病理學(xué)形態(tài)檢測(cè) 蛋白質(zhì)技術(shù) 免疫學(xué)檢測(cè) 提供培訓(xùn)服務(wù)各種檢驗(yàn)儀器設(shè)備,、玻璃儀器及器具,、一次性耗材等
一、技術(shù)定義與核心原理
原核注射是將外源DNA直接注入受精卵的雄性原核(體積較大且易定位),,使外源基因隨機(jī)整合至宿主基因組的技術(shù)。其核心機(jī)制包括:
隨機(jī)整合:外源DNA通過非同源末端連接(NHEJ)插入染色體,,整合位點(diǎn)與拷貝數(shù)不可控。
原核優(yōu)勢(shì):雄性原核(由精子形成)比雌性原核更易定位,,且DNA修復(fù)活性高,。
瞬時(shí)表達(dá)窗口:受精卵處于單細(xì)胞期,,DNA修復(fù)系統(tǒng)活躍,利于外源片段整合,。
生物學(xué)基礎(chǔ):
受精后12-24小時(shí)為最佳操作窗口(小鼠),,此時(shí)原核清晰可見。
二,、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程
(一)前期準(zhǔn)備
步驟 | 關(guān)鍵操作與參數(shù) |
---|---|
載體構(gòu)建 | 線性化載體(避免質(zhì)粒骨架整合) + 必需元件(啟動(dòng)子,、編碼區(qū)、polyA) |
受精卵獲取 | 超排卵處理雌鼠(PMSG/hCG)→ 與雄鼠合籠→ 取見栓后0.5天的受精卵 |
顯微注射系統(tǒng)校準(zhǔn) | 注射針內(nèi)徑1-2μm,,壓力5-10 hPa,單次注射體積2pL(含1-2ng DNA) |
(二)注射與胚胎移植

存活率控制:注射后受精卵存活率需>80%,。
移植時(shí)機(jī):發(fā)育至2細(xì)胞期再移植,可提高著床率,。
(三)首建鼠(Founder)鑒定
基因型檢測(cè):
PCR法:提取鼠尾DNA,擴(kuò)增外源基因,。
Southern Blot:驗(yàn)證拷貝數(shù)與整合完整性,。
表達(dá)驗(yàn)證:
Western Blot(蛋白水平)或RT-PCR(轉(zhuǎn)錄水平)。
首建鼠特性:
每只Founder為獨(dú)立品系(因隨機(jī)整合位點(diǎn)不同),,需分別建系,。