兔棕色脂肪原代細胞

兔棕色脂肪細胞分離自棕色脂肪組織；動物體內(nèi)存在棕色和白色兩種脂肪,，白色脂肪堆積在皮下,，負責儲存多余熱量；棕色脂肪負責分解引發(fā)肥胖的白色脂肪,，將后者轉(zhuǎn)化成二氧化碳,、水和熱量，本身不儲存熱量。棕色脂肪組織呈棕色,，其特點是組織中有豐富的毛細血管,，脂肪細胞內(nèi)散著許多小脂滴，線粒體大而豐富,，核圓形,，位于細胞中央，這種脂肪細胞也稱為多泡脂肪細胞,。棕色脂肪組織在成年動物極少,，新生兒及冬眠動物較多，在新生兒主要分布在肩胛間區(qū),、腋窩及頸后部等處,。棕色脂肪組織僅在嬰兒時期發(fā)揮作用，它們堆積在新生兒肩胛處,，幫助維持體溫,。隨著年齡增長，棕色脂肪會逐漸消失,。終,，動物體內(nèi)只殘存少量棕色脂肪細胞，分布于頸部和鎖骨,。脂肪細胞分為白色脂肪細胞和褐色（棕色）脂肪細胞,，常呈白色，在嬰幼兒期大量增殖,，到青春期數(shù)量達到巔,，此后數(shù)量一般不再增加。細胞內(nèi)含有大量富含脂肪的小泡,，稱為脂質(zhì)泡,，富含光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。此外,，還有一種褐色脂肪細胞,，在動物體內(nèi)主要存在于肩胛骨間、頸背部,、腋窩,、縱隔及腎臟周圍，含有高度團縮的褐色脂肪,，作用是將脂質(zhì)分解產(chǎn)熱,，調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)比例。

產(chǎn)品名稱：兔棕色脂肪細胞

組織來源：脂肪

產(chǎn)品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

包被條件：PLL(0.1mg/ml)

培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基,，含FBS,、EGF、Insulin,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：梭形、多角形

傳代特性：屬于終末分化細胞,；屬于不增殖細胞群

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

兔棕色脂肪細胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

方法簡介

實驗室分離的兔棕色脂肪采用膠原酶-酶聯(lián)合消化法獲得前脂肪細胞,，經(jīng)成脂誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔棕色脂肪經(jīng)油紅O染色檢測,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻,。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液,，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次,。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分 變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液,，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時,，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類,；

1. 細胞凍存時,，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細胞變圓 脫 落后,，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù),。