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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔棕色脂肪干采用膠原酶消化法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔棕色脂肪干經(jīng)CD90免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

細胞簡介：

兔棕色脂肪干細胞分離自棕色脂肪組織；動物體內(nèi)存在棕色和白色兩種脂肪,，白色脂肪堆積在皮下,，負責(zé)儲存多余熱量；棕色脂肪負責(zé)分解引發(fā)肥胖的白色脂肪,，將后者轉(zhuǎn)化成二氧化碳,、水和熱量，本身不儲存熱量,。棕色脂肪組織呈棕色,，其特點是組織中有豐富的毛細血管，脂肪細胞內(nèi)散著許多小脂滴,，線粒體大而豐富,，核圓形，位于細胞中央,，這種脂肪細胞也稱為多泡脂肪細胞,。棕色脂肪組織在成年動物極少，新生兒及冬眠動物較多,，在新生兒主要分布在肩胛間區(qū),、腋窩及頸后部等處,。棕色脂肪組織僅在嬰兒時期發(fā)揮作用,，它們堆積在新生兒肩胛處，幫助維持體溫,。隨著年齡增長,，棕色脂肪會逐漸消失。終,，動物體內(nèi)只殘存少量棕色脂肪細胞,，分布于頸部和鎖骨。脂肪干細胞（ADSCs）是一種具有多向分化潛能的干細胞,，主要恢復(fù)組織細胞的修復(fù)功能,，促進細胞的再生，恢復(fù)年輕面容的同時,，身體機能也得到充分改善,，有效改善亞健康、早衰等疾病,，由內(nèi)而外真正的有效抵抗衰老,。脂肪干細胞具有很多優(yōu)點：①具有自我更新及多向分化的潛能,；②來源充足；③對供區(qū)的創(chuàng)傷較??；④獲得率及體外擴增速率高。脂肪干細胞是目前被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域中理想的種子細胞,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

兔棕色脂肪干細胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次,，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍,。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：