適用機(jī)型（包括但不限于）：

◆ ABl QuantStudio 3 qPCR 儀

◆ 羅氏LC96 Real-Time PCR System

◆ AB1 7500 Real-Time PCR System

◆ 伯樂 CFX Opus96 Real-Time PCR System

◆ 鯤鵬ArchimedTM X Real-Time PCR System

需要準(zhǔn)備的耗材與設(shè)備：

◆熒光定量 PCR 儀

◆ 1000uL，100uL,，10uL移液槍

◆ 1.5mL 無菌離心管

◆ 1000μL,，100uL,，10μL無菌低吸附帶濾芯吸頭

◆ 無菌無酶八聯(lián)管或 96 孔 qPCR 板

試驗(yàn)流程：

一,、 qPCR 反應(yīng)液的制備和加樣

1、根據(jù)所需檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品數(shù)量(一般做3 組復(fù)孔),，計(jì)算反應(yīng)所需孔數(shù):
反應(yīng)孔數(shù)=(6 組參考品+1個(gè)無模板對(duì)照 NTC+待測(cè)樣品)x3
2,、根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 Vero qPCR MIX 總量:
Vero qPCRMIX=(反應(yīng)孔數(shù)+2或3)x20uL(2 或3為操作損失量)
3、將所用試劑置于冰上融化,，輕微振蕩混勻,，按下表所示配制Vero qPCR MIX：

4.將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻,，按下表所示加樣(總體積 30uL):

二、 qPCR 反應(yīng)程序和參數(shù)設(shè)置

以 BIO-RAD 公司 CFX96 qPCR 儀為例,。

1,、設(shè)置反應(yīng)程序:

2、創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板,，點(diǎn)擊 Select Fluorophores 選擇熒光 FAM;在反應(yīng)板圖表中,，選擇樣品孔，在 Sample Type 中下拉選擇 Unknow,，勾選熒光 FAM,，Target Name 命名為 Vero;輸入每個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)及 Sample Name。

在反應(yīng)板圖表中,，選擇標(biāo)曲孔,，在 Sample Type 中下拉選擇 Standard，勾選熒光 FAM,，Target Name 命名為 Vero;輸入每個(gè)稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及SampleName,。并且分別在STD1，STD2,，STD3,，STD4，STD5,，STD6的Concentration 一欄賦值為 300000,、30000,、3000、300,、30,、3(單位為fg/uL)。

3,、點(diǎn)擊 Run 界面的“Start Run”按鈕進(jìn)行 PCR 測(cè)定,。

程序 Stage3 中 60°C 30s處設(shè)置為熒光收集

三、 qPCR 結(jié)果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點(diǎn)擊資料分析視窗Quantitation,，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）,、截距（Intercept）、擴(kuò)增效率（Effect）,、R2,。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對(duì)照NTC,、NCS,、待測(cè)樣本的檢測(cè)值，單位為fg/μL,。
3. 陰性對(duì)照 NTC和 NCS 的 CT值都應(yīng)大于標(biāo)曲最-低濃度的 CT值或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身驗(yàn)證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn),。

注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證，無需分裝,。

2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測(cè)樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域,，不可在一個(gè)區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊,，戴好口罩,、手套和穿好潔凈服。

3. 注意在不同加樣步驟間及時(shí)更換吸頭,，避免交叉污染,，避免長時(shí)開蓋。

4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用,。

5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用,。

6. 只有嚴(yán)格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測(cè)效果,。

7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測(cè),，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性,、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),。

9. 公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé),，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量,，預(yù)留充足的樣本,。

10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷,。

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現(xiàn)貨供應(yīng)：公司庫存充足,，可快速發(fā)貨,，減少用戶等待時(shí)間。

效期保障：嚴(yán)格把控產(chǎn)品質(zhì)量,，確保試劑效期新鮮,，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,。

專業(yè)技術(shù)支持：提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)指導(dǎo),，幫助用戶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高實(shí)驗(yàn)成功率,。

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