細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（cell-wall binding acid invertase, B-AI）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶試劑盒 蔗糖

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase,，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一,。根據(jù)最適 pH,，Ivr 分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）兩種類型。

AI 的最適pH 為 3～5,。AI 分為可溶性AI(S-AI)和細(xì)胞壁不溶性 AI（B-AI）兩種類型,。B-AI 存在于細(xì)胞間隙并結(jié)合在細(xì)胞壁上，主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時蔗糖的分解,，以維持庫源之間蔗糖的濃度,。

測定原理：

B-AI 催化蔗糖降解產(chǎn)生還原糖，進(jìn)一步與 3,5－二硝基水楊酸反應(yīng),，生成棕紅色氨基化合物,，在 510nm有特征光吸收，在一定范圍內(nèi) 510nm 光吸收增加速率與B-AI 活性成正比,。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶,，4℃保存；臨用前加入 25ml 試劑一充分溶解備用,；用不完的試劑 4℃保存;

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、臺式離心機(jī)、水浴鍋,、移液器,、1ml 玻璃比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液 1 體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液 1）,，進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心 10min,，棄上清,，沉淀中加入 1ml 蒸餾水，充分震蕩混勻,，12000g 4℃離 心 10min,，棄上清,，沉淀中加入 1ml 提取液 2 充分混勻，4℃浸提過夜,，12000g 4℃離心 20min,，取上清置冰上待測。

測定步驟和加樣表：

混勻,， 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后,，95℃水浴 10min（蓋緊，以防水分散失）,，流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

混勻,，95℃水浴 10min（蓋緊，以防止水分散失）,，流水冷卻后充分混勻,， 510nm 處，蒸餾水調(diào)零,，記錄各管吸光值 A,，如果吸光值大于 2，可以用蒸餾水稀釋后測定(計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),，ΔA=A 測定-A 對照,。

B-AI 活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/ml）,，y 為吸光值,。

按蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：37℃每mg 蛋白每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI 活性（μg/min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

按鮮重計(jì)算：

單位的定義：37℃每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位,。

B-AI 活性（μg/min/g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.2ml；V2：加入提取液體積,，1ml,；T：反應(yīng)時間，30min,； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本鮮重,，g,。

細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶試劑盒 蔗糖