乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase,，ADH）活性測定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

乙醇脫氫酶活性測定試劑盒 輔酶Ⅰ

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做定。測定意義：

ADH 是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關鍵酶,，催化乙醇與乙醛可逆轉換,，在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH 主要在肝臟生成,，肝臟損傷導致ADH 釋放到血清中,。血清ADH 活性高低反映了肝功能是否異常。

測定原理：

ADH 催化NADH 還原乙醛生成乙醇和NAD⁺,，NADH 在 340nm 處有吸收峰,，而 NAD⁺沒有；測定 340nm吸光度下降速率,，來計算ADH 活性,。

組成：

試劑三：粉劑×2 瓶，－20℃保存,。臨用前加入 22ml 試劑二,，現(xiàn)配現(xiàn)用。

自備儀器和用品：

研缽,、冰,、低溫離心機、紫外分光光度計,、1ml 石英比色皿,、可調式移液器和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1,、組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 試劑一）進行冰浴勻漿。16000g,，4℃離心 20min,，取上清置冰上待測。

2,、細菌,、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w,，超聲 3 秒,，間隔 7 秒，總時間 3min）,；16000g,， 4℃離心 20min，取上清液置冰上待測,。

3,、血清等液體：直接測定。

ADH 測定操作：

分光光度計預熱 30 min,，調節(jié)波長到 340 nm,，蒸餾水調零。

試劑三在 25℃水浴中保溫 30 min,。

在 1ml 石英比色皿中依次加入 100μl 樣本上清液,、800μl 試劑三和 100μl 試劑四，迅速混勻后于 340nm

測定吸光值變化,，分別記錄 15s 和 75s 時吸光值,，分別記為A1 和A2?！鰽 測定管=A1-A2,。

計算公式：

按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×109) ÷(Cpr×V 樣)÷T

=1608×△÷Cpr

按照樣本質量計算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位,。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V 反總×109) ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×△A÷W

按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每 104 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位,。

ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V 反總×109)÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×△A ÷細胞數(shù)量

按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。

ADH (nmol/min/ml) =(△A÷ε÷d×V 反總×109) ÷V 樣÷T

=1608×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×103L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1 cm,；V 反總：反應體系總體積,，1000μl=0.001 L,；Cpr：上清液蛋白質濃度,，mg/ml,；W：樣本質量，g,；V 樣：加入反應體系中上清液體積,，100μl=0.1 ml； T：反應時間,，1min,。

乙醇脫氫酶活性測定試劑盒 輔酶Ⅰ