基本信息

細胞名稱 : MOC1細胞系

T150燒瓶 : 07-200-64

T75燒瓶 : 10-126-37

冷 凍 劑 : 03-374-059

45um過濾器 : 09-754-21

惰性譜線 : MOC1,22

侵略性線 : MOC2

IMDM : sh30228.02 Hams

營養(yǎng)混合物 : F10-F12sh30026.01胎牛血清,，特征-海克隆

目錄 / 批次號 : sh30071.03 / AWK24001

過濾1L過濾器瓶的過濾器 : 09-761-108

科學試劑目錄編號 : 胰島素：I6634-50mg　H0135-1mg　　　

EMD微孔試劑目錄編號 : 表皮生長因子(EGF），重組人：01-107

解凍細胞系

1. 在解凍前,，將21ml IMDM MOC線培養(yǎng)基加入到T150中(如果想解凍成T75,，則將10ml加入到T75 中）

2. 將液氮從冷凍瓶中取出，噴上含有70%酒精的小瓶進行清洗,。

3.將冷凍瓶的下半部分放在37攝氏度的水浴中(不讓蓋子接觸水,，以避免污染），直到 有一小塊冰漂浮著,。

4.再次用ETOH噴灑冷凍瓶,，然后放在引擎蓋上。將1ml培養(yǎng)液移液管加入到1ml細胞中,，并將這 些2ml加入到已經(jīng)含有培養(yǎng)基的T150中(使一個T150總共有22ml）,。

5.在T150燒瓶中取一些培養(yǎng)基，沖洗冷凍瓶,，然后平板放置,，以確保所有殘留的細胞都留在冷 凍瓶中。

冷凍細胞系

1. 從T150中收集細胞,，如下圖所示

2. 在15ml錐形管中旋轉(zhuǎn)成顆粒(1000 RPM x5分鐘）

3. 排出上清液

4. 點擊15ml圓錐形管,，重懸細胞

5. 加入1.5ml IMDM MOC系培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中重建細胞-保持冰上

6. 管入冰時緩慢加入1.5 ml冷凍介質(zhì)(在IMDM MOC線介質(zhì)中制作冷凍介質(zhì)-20%DMSO,。例：20ml庫存-加入16ml IMDM MOC線培養(yǎng) 基和4ml DMSO,。注射器過濾器，使用um過濾器

7. 每份1毫升到3個冷凍瓶

8. 在-80攝氏度內(nèi)儲存不超過2周

9. 在1-2周內(nèi)放入液氮溶液中

注 ： 如果需要,，可增加到2ml IMDM和2ml冷凍培養(yǎng)基,，以儲存在4個小瓶中。此外,，最好在冷凍細胞 前計數(shù)細胞并記錄在小瓶上,。

細胞系特征

1. 惰性- MOC1：基于體內(nèi)研究的侵襲性較低。如果從80%合流T150通過1：12,，需要2-4天才能達到80%合 流,。與更具侵襲性的細胞系相比，MOC1細胞系在收獲時需要的時間更長,。

2. 侵襲性- MOC2：基于體內(nèi)研究,，更具侵襲性。如果從80%合流T150通過1：12,，需要2-4天才能達到 80%合流,。與惰性細胞系相比，惰性細胞系更容易從燒瓶中分離出來,。

從T150收集和傳遞細胞/80%融合

1. 將T150中的介質(zhì)倒入傾倒瓶中

2. 用10-20ml PBS清洗一次,。倒出PBS清洗液,。

3. 加入1.5ml 0.05%，確保覆蓋整個表面積,，從而接觸所有細胞(這樣做,，使細胞不會暴露在中太久），然后再應用1,。5ml0.25%,。

4. 放置在37C培養(yǎng)箱中。侵襲性細胞系孵育3-4分鐘,，惰性反應可達10-12 min,，但在6-8 min后 檢查。

５. 故意敲擊燒瓶一側(cè)的手掌幾次,，使細胞松動,。

6. 在顯微鏡下檢查，看細胞在培養(yǎng)基中是否能自由漂浮,。如果大多數(shù)沒有,，請放回37C培養(yǎng)箱中 再放置3-5分鐘。盡量不要讓細胞在中停留,，因為這樣會殺死細胞,。

7. 一旦所有或大部分細胞漂浮，加入10ml IMDM MOC線培養(yǎng)基來中和反應,。

8. 移液管培養(yǎng)基和細胞從燒瓶中進入15ml的錐形細胞到顆粒細胞,。離心機,，1000 RPM x 5 min,。

9. 倒出上清液。

10. 以1：12的速度通過細胞-在另外12毫升的培養(yǎng)基中重懸細胞,。

1１. 從其中取出1ml,，放入新的T150燒瓶中，總體積為22ml的IMDM MOC系培養(yǎng)基(稀釋1：12）

1２. 放回37C的培養(yǎng)箱中生長,。應在2-4天內(nèi)達到80%的合流率,。

注入小鼠側(cè)腹(異位）所需細胞濃度：

MOC1，MOC22：(用0.15ml注射1e6細胞）=6.66e6細胞/ml

MOC2：(用0.15ml注射1e5細胞）=6.66e5細胞/ml

1. 用0獲取細胞,。如上所述,。

2. 用IMDM MOC系培養(yǎng)基中和后，將細胞旋轉(zhuǎn)成50ml錐形的顆粒(1000 RPM x5分鐘）,。 注：使用50ml錐形,，允許小尺寸針抽出細胞供注射。

3. 用10ml冰水PBS重懸細胞顆粒(確保盡可能多地去除含有FCS的介質(zhì)）,，再次將細胞旋轉(zhuǎn)成顆 粒(1000 RPM x5分鐘）

4. 用3-6 ml冰PBS重懸細胞顆粒再次清洗細胞(體積取決于顆粒的大小,，因為你將使用這個體積 來計數(shù)細胞）

5. 使用血細胞計數(shù)儀或自動細胞計數(shù)器計數(shù)每毫升的細胞,，使用臺盼藍來消除死亡細胞。使用 存在的細胞總數(shù)(細胞/mlx總PBS的mlPBS）,，計算重懸細胞顆粒所需的體積,，以達到6.66e6(MOC1，MOC22）或6.66e5 cell/ml(MOC2）濃度,。

例如：MOC1的細胞計數(shù)為： 2.8e6細胞/mlx5ml(PBS）=14e6細胞總數(shù),。14e6細胞/ 6.66e6細胞/ml=2.1mlPBS將細胞顆粒懸浮在其中。

6. 再次將細胞旋轉(zhuǎn)成小顆粒,。倒出PBS上清液(不）,。在計算體積的冰PBS中重懸顆粒以達到 適當?shù)臐舛龋涀」嘧⑸锨搴?0ml錐形中還有 200ul,。

7. 將50ml錐形冰轉(zhuǎn)移,，每只小鼠皮下注射0.15ml(150ul）細胞。

8. 按照標準協(xié)議注入鼠標,。MOC1細胞系我們用1毫升注射器,。我們用1.5英寸21號針繪制細胞，并將針切換 到?英寸26號針進行注射,。

1L媒體協(xié)議將培養(yǎng)基為2：1 IMDM制成營養(yǎng)混合物

1. 解凍胎牛血清和賓州/鏈球菌在37攝氏度

2.1L過濾瓶加入626ml IMDM和313ml營養(yǎng)混合物

3.添加50毫升FCS

4.添加10ml Penn流

5.過濾器

6.加入1ml5mg/ml胰島素(或500ul,，10mg/ml)

注：

用10ml無菌H20稀釋胰島素50mg粉末，加50ul無菌1N鹽酸,，4C箔保存

7.加入40ug

注：將Sigma中氫酮稀釋1mg粉制成19ml無血清IMDM和1ml 100%乙醇,，制成20ml。每升使用800ul,。在-20處存儲等分,。

8.添加5ug EGF

注：

使EGF - make 1ug/ul原液用無血清IMDM稀釋，每升加入5ul,。在-80處存儲等分,。