2-8℃ 避光

開蓋后組份按要求條件保存,。

6個(gè)月

分光光度計(jì)

血清血漿/全血/組織

分光光度計(jì)

1.分光光度計(jì)
2.臺(tái)式離心機(jī)
3.移液器
4.恒溫水浴鍋

1.蒸餾水

1.吸頭
2.一次性手套

1.旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心,，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落,。
2.空白管,、標(biāo)準(zhǔn)管一般只需做1-2只
3.在正式實(shí)驗(yàn)前務(wù)必做預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索取樣濃度。取樣量及取樣濃度因樣品種類不同,，其GSH-PX活力不一,。根據(jù)酶的百分抑制率與酶的活力呈拋物線關(guān)系，各種測(cè)定樣品取樣量及取樣濃度不一樣，在每測(cè)定一種新的樣品前選擇一個(gè)取樣量及取樣濃度,；
4.溶血液在室溫1小時(shí)內(nèi)活力不變,，建議樣品稀釋后不超過(guò)1小時(shí)測(cè)試。
5.血樣要新鮮,。肝素抗凝后放冰箱不超過(guò)48小時(shí),。
6.試劑A的瓶子要洗干凈，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配,。
7.GSH標(biāo)準(zhǔn)品要現(xiàn)用現(xiàn)配,。
8.37℃水浴反應(yīng)時(shí)間5分鐘要準(zhǔn)確。
9.測(cè)定上清液當(dāng)天提取,，當(dāng)天測(cè)定,；

一、樣本制備：
血清,、血漿樣本： 按常規(guī)方法制備,，可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，-20℃凍存,。

二,、試劑的配制

GSH工作液的配制：


全血GSH-PX活力測(cè)定

1、樣本處理
溶血液配制：
⑴ 取肝素抗凝全血20ul,，用蒸餾水稀釋至1ml,，配成1:49的溶血液；
鼠血10ul,，用蒸餾水稀釋至1ml,，配成1:99的溶血液。
⑵ 充分混勻,，放置5分鐘直至玻璃管中的溶血液對(duì)光呈透明狀,，方可進(jìn)行檢測(cè)。
⑶ 配好的溶血液中GSH-PX活力只能保持45分鐘-60分鐘,，室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120分鐘,。抗凝全血可在2-8℃保存2-3天,。
注：1,、測(cè)溶血液中GSH-PX含量要注意樣品測(cè)試前紅細(xì)胞一定要充分溶血。
2,、正式實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先取1~2個(gè)樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),；

2、GSH-PX酶活力測(cè)定：
⑴ 酶促反應(yīng)：（注：試劑A工作液提前在37℃預(yù)溫）


⑵ 顯色反應(yīng)：按下列配方和步驟進(jìn)行

3,、全血中GSH-PX的活力的計(jì)算：
⑴ 定義：每4ul全血在37℃反應(yīng)5分鐘,，扣除非酶促反應(yīng)的作用,，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1umol/L為一個(gè)酶活力單位。
⑵ 計(jì)算：
非酶管OD-酶管OD 1+X
GSH-PX酶活力= X標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20umol/L）X 稀釋倍數(shù)（5X ）
標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD 1+49
注： 5：從酶促反應(yīng)表中反應(yīng)液0.5ml加試劑B2ml,，在反應(yīng)液中為5倍稀釋,，所以乘5.
X：為全血稀釋比例，例如1:99稀釋,，X為99
1+49：溶血液為1:49稀釋時(shí),，取0.2ml檢測(cè)即等同于取樣量為4ul的全血。

4,、溶血液的取樣濃度及取樣量的摸索舉例,；
1.樣本來(lái)源：正常組新鮮大鼠尾部全血；
2.樣本前處理：分別用蒸餾水將大鼠全血按1：24,、1:49,、1:59、1:69,、1:79,、1:89、1:99,、1:149,、1:199的比例稀釋成一系列不同濃度的溶血液，分別取一系列不同濃度溶血液0.2ml按全血的測(cè)定操作表進(jìn)行檢測(cè),。

5,、計(jì)算舉例：
A: 取1:49溶血液0.2ml進(jìn)行測(cè)定,，測(cè)得非酶管OD值0.463,，酶管OD值為0.228，標(biāo)準(zhǔn)管OD值為0.165,，空白管OD值0.041,，
酶活力=（0.463-0.228）/ (0.165-0.041) X 20 X 5 X 50/50 =189.52酶活力單位
B: 取1:149溶血液0.2ml進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得非酶管OD值0.451,，酶管OD值為0.205,，標(biāo)準(zhǔn)管OD值為0.165，空白管OD值0.041,，
酶活力=（0.451-0.205）/ (0.165-0.041) X 20 X 5 X 150/50 =595.16酶活力單位

組織,、線粒體、細(xì)胞膜GSH-PX活力測(cè)定

1,、樣本處理
10%組織勻漿的制備：
⑴ 取組織塊200mg-1g,，用冷生理鹽水漂洗，除去血液,，濾紙拭干,，稱重，放入5-10ml的小燒杯內(nèi)。
⑵ 用量筒量取9倍重量的預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（pH7.4,0.01mol/L蔗糖,，0.01mol/L Tris-HCl,，0.0001mol/L EDTA2Na溶液）或生理鹽水。用移液器將總量2/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水移入燒杯,。用眼科小剪刀盡快剪碎組織塊（天熱時(shí)小燒杯要放入冰水中）,；
⑶ 將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水用來(lái)沖洗殘余在小燒杯中的碎組織一起倒入玻璃勻漿管中進(jìn)行勻漿（6-8分鐘）,。充分磨碎,，使組織勻漿化；也可使用組織搗碎機(jī)10000-15000r/min,，研磨制成10%組織勻漿,；
⑷ 將制備好的10%勻漿3000r/min離心10-15分鐘，取上清,。

線粒體的制備：
取10%組織勻漿5-10ml,，以1000-2000r/min離心10分鐘，取上清,，8000-10000r/min離心15分鐘,，沉淀為線粒體。

2,、GSH-PX酶活力測(cè)定：
⑴ 酶促反應(yīng)：（注：試劑A工作液提前在37℃預(yù)溫）

⑵ 顯色反應(yīng)：按下列配方和步驟進(jìn)行
↓
混勻,。室溫靜置15分鐘，412nm處,，1cm光徑比色杯,，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各OD值,。

3,、組織中GSH-PX的活力的計(jì)算：
⑴ 定義：每mg蛋白質(zhì)，扣除非酶促反應(yīng)的作用,，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1umol/L為一個(gè)酶活力單位,。
⑵ 計(jì)算：
非酶管OD-酶管OD
GSH-PX酶活力= X標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20umol/L）X稀釋倍數(shù)（5）÷反應(yīng)時(shí)間
標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD

÷(取樣量X樣本蛋白濃度)

注： 1.從酶促反應(yīng)表中反應(yīng)液0.5ml加試劑B2ml，在反應(yīng)液中為5倍稀釋,，所以乘5.
2.組織蛋白的測(cè)定：可以用BCA 或Bradford蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,；
4、組織勻漿的取樣濃度及取樣量的摸索舉例,；
（1）樣本來(lái)源：正常組小鼠肝組織,，制備成10%肝勻漿上清，用生理鹽水稀釋成1%,，待測(cè),；
（2）樣本前處理：分別用生理鹽水將1%肝勻漿稀釋成1.0%,、0.5%、0.4%,、0.3%,、0.25%、0.2%,、0.1%,、0.05%一系列不同濃度的組織勻漿，分別取一系列不同濃度組織勻漿0.2ml按組織的測(cè)定操作表進(jìn)行檢
5,、計(jì)算舉例：
取0.25%小鼠肝組織勻漿0.2ml進(jìn)行測(cè)定,，測(cè)得非酶管OD值0.480，酶管OD值為0.172,，標(biāo)準(zhǔn)管OD值為0.163,，空白管OD值0.041，1%勻漿蛋白濃度0.910mg/ml,，
酶活力=（0.480-0.172）/ (0.163-0.041) X 20 X 5 ÷（0.910÷4*0.2）=1109.71酶活力單位
測(cè)酶活力用0.25%勻漿,，蛋白定量用1%勻漿，所以除以4.

血清,、血漿GSH-PX活力測(cè)定

1,、GSH-PX酶活力測(cè)定：
⑴ 酶促反應(yīng)：（注：試劑A工作液提前在37℃預(yù)溫）
⑵ 顯色反應(yīng)：按下列配方和步驟進(jìn)行
2、血清中GSH-PX的活力的計(jì)算：
⑴ 定義：每0.1ml血清在37℃反應(yīng)5分鐘,，扣除非酶促反應(yīng)的作用,，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1umol/L為一個(gè)酶活力單位。
⑵ 計(jì)算：
非酶管OD-酶管OD
GSH-PX酶活力= X標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20umol/L）X稀釋倍數(shù)（6）
標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD

X測(cè)試前稀釋倍數(shù)

注： 從酶促反應(yīng)表中反應(yīng)液0.4ml加試劑B2ml,，在反應(yīng)液中為6倍稀釋,，所以乘6.

4、血清（漿）的取樣濃度及取樣量的摸索舉例,；
（1）樣本來(lái)源：正常組大鼠眼眶取全血,，抗凝取血漿,；
（2）樣本前處理：分別用生理鹽水將血漿按1:1,、1:4、1:7,、1:9,、1:14、1:19一系列不同濃度的血漿,，分別取一系列不同濃度血漿0.1ml按血清（漿）的測(cè)定操作表進(jìn)行檢