在微生物研究,，尤其是細菌學(xué)中,，對菌體計數(shù)是一項最基本的需求。常規(guī)的計數(shù)方法主要是國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的平板計數(shù)法和顯微鏡計數(shù)法,，但它們耗時長、誤差大,，且平板法只能計數(shù)活菌,。

近年來，隨著熒光染料,、結(jié)構(gòu)光學(xué)和流式細胞儀技術(shù)的不斷發(fā)展,，流式細胞術(shù)檢測細菌等微生物成為可能。與傳統(tǒng)檢測方法相比,，其具有靈敏,、快速、高效,、精確的優(yōu)勢,，流式細胞術(shù)已經(jīng)成為微生物研究中的一個重要工具，在單細胞層面對細菌結(jié)構(gòu)和功能的多項參數(shù)進行更深層的分析,，以研究細菌的異質(zhì)性和鑒定細菌種屬,。

本方案以大腸桿菌為例，介紹層浪流式細胞儀如何評估活菌比例和計數(shù)。

——實驗背景——

膜的完整性評估是細菌活力的重要評價手段,，通常使用膜滲透性和非滲透性熒光染料來進行活力測試,，目前比較常見的染料是SYTO 9/PI。

SYTO 9 作為一種可滲透的綠色熒光核酸染料,，被動擴散進入細胞內(nèi),，既可以進入細胞膜完整的細菌中，也可以進入細胞膜受損的細菌中,，與核酸染料結(jié)合,。而紅色熒光核酸染料PI只能進入不完整細胞膜的細菌中。當(dāng)SYTO 9和PI同時加的時候,，PI染料進入膜內(nèi),，會導(dǎo)致SYTO 9熒光染料的降低。因此,，具有完整細胞膜的細菌呈現(xiàn)綠色,，而膜不完整的細菌呈現(xiàn)紅色。


圖1：SYTO 9/PI細菌活力測定法原理示意圖

——樣本處理——

1. 收集對數(shù)生長期的大腸桿菌,，10000g,，5min，離心洗滌,，取細胞沉淀重懸于0.22um過濾的無菌PBS中,；

2.進行細菌計數(shù)，為后續(xù)染色做準(zhǔn)備,；

3. 取4個流式管,，標(biāo)記為空白組，SYTO 9和PI單染組,，樣本組,。每個試管加100ul細菌懸液，保證細菌數(shù)在10⁶-10⁷左右,。

——樣本染色——

1. 根據(jù)廠家試劑盒建議,，單染組分別加1ul SYTO 9或1ul PI，樣本組加1ul SYTO 9和1ul PI,，加PBS至988ul,。渦旋，室溫避光孵育15min,；

2. 充分渦旋微球,，每管分別加10ul，每份樣本中體系為1000ul,；

3. 設(shè)置參數(shù),，用層浪FongCyte流式細胞儀采集信號,，SYTO 9（Max Ex/Em=485/498nm）用FITC通道檢測，PI（Max Ex/Em=535/617nm）用PerCP通道檢測,，兩個通道光譜重疊小,，補償易調(diào)節(jié)。

——數(shù)據(jù)分析——

1. 細菌比較小,，選擇對數(shù)模式分析,。設(shè)置合適的電壓，使細菌群信號在流式圖中間清晰地呈現(xiàn),。設(shè)置合適的閾值,，很大程度減少背景噪音。此實驗中,，設(shè)置的是FSC和FITC雙閾值,；

2. 根據(jù)FSC和SSC，圈出主細菌,，右上角的一群是微球（圖2）,；

3. 從主細菌中，選擇SYTO 9和PI,，紅光區(qū)域的代表死菌,，綠光區(qū)域的代表活菌（圖3）。

——總結(jié)——

1. 原核生物平均直徑在1um左右,，需要挑選合適的流式細胞儀,。層浪的流式細胞儀檢測直徑在0.1-50um，除大腸桿菌外,，還可以檢測葡萄球菌、酵母,、浮游生物,、益生菌等；

2. 層浪流式細胞儀可以獲得體積法絕dui計數(shù),，跟微球法結(jié)果有較高的一致性,，節(jié)約實驗經(jīng)費；

3. 細菌活力染色實驗對管路的潔凈度要求高,，層浪流式細胞儀每管樣本間采樣針自動清洗,，攜帶污染率為0.05%，能夠獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果,。

數(shù)據(jù)來源 : 廣州某實驗室

層浪： 您好,，可以采訪下您近期使用層浪流式細胞儀的感受嗎？

客戶： 可以的,。

層浪：  在層浪的儀器上,，您們?nèi)粘６甲瞿男颖荆?/span>

客戶：  我們實驗室開展多種流式實驗，在微生物方面，除了細菌,，還做酵母,、益生菌檢測等。

層浪：  您對于層浪的儀器,，有哪些使用感受和反饋嗎,？

客戶：  我們之前用平板法培養(yǎng)細菌進行計數(shù)，這種方式只能培養(yǎng)活菌,，通常耗時3天左右,，而流式細胞術(shù)對活菌和死菌都可以計數(shù)，比平板法的計數(shù)結(jié)果會高一些,，更準(zhǔn)確一些,，而且靈敏、檢測速度快,、時間短,，極大地提高了我們出數(shù)據(jù)的效率，我們現(xiàn)在逐漸用流式替代平板法了,。

層浪：  確實,，現(xiàn)在流式細胞儀在微生物研究中的作用越來越廣泛了。

客戶：  我們實驗室之前有一款進口的流式細胞儀,，現(xiàn)在使用貴司的儀器,，非常喜歡您們的軟件！中文的界面,，功能鍵直觀,，而且操作簡單。細菌實驗對儀器的清潔度要求高,，還要避免管路之間的交叉污染,，之前我們是上完一個樣本，再上一管水,，進行反沖,。而您們的儀器每個樣本之間能夠進行采樣針清洗，免去了我們每管樣本手動清洗的麻煩,。做普通清洗和深度清洗也很方便,，使用的清洗液用量也不大。

層浪：  非常感謝您的反饋,。層浪會繼續(xù)努力,，用心服務(wù)每一位客戶。


圖4：層浪生物FongCyte™3光14色流式細胞儀

參考文獻：

1,、劉新星,霍轉(zhuǎn)轉(zhuǎn).流式細胞術(shù)在細菌快速檢測中的應(yīng)用,；微生物學(xué)通報,。DOI:10.13344/j.microbiol.China.130041.

2、鄧穎,基于流式細胞術(shù)的SYTO 9/PI細菌活性判定方法優(yōu)化及其機理;暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文.

3,、Philipp Stiefel, Sabrina Schmidt-Emrich,Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.DOI 10.1186/s12866-015-0376-x.

4,、S M Stocks,Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight.doi: 10.1002/cyto.a.20069.

5、Martin G. Wilkinson,Flow cytometry as a potential method of measuring bacterial viability in probiotic products: A review.//doi.org/10.1016/j.tifs.2018.05.006.