2-8℃ 避光

開蓋后組份按要求條件保存。

6個月

血清血漿/組織/細胞

1.分光光度計
2.恒溫水浴鍋
3.漩渦混勻器
4.離心機
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.純水
2.無水乙醇

1.離心管
2.吸頭

1.管子要洗干凈,，先用溫肥皂水刷凈,，再用自來水沖洗20遍以上，最后用純水過1-2次后烘干即可,；
2.試劑B配制時要加熱充分溶解（溫度可達90-100℃）,；
3.肝素抗凝全血放置冰箱存放時間不可超過3天，血漿,、組織塊放-20℃可保存一個月,；
4.試劑A配成儲備液后,，冰箱冷藏至少可保存一個月,；
5.1mmol/L的GSH底物現(xiàn)配現(xiàn)用；
6.上清液當(dāng)天提取當(dāng)天測定,；
7.樣品前處理參照實驗方法學(xué)部分,；

試劑配制
1. 試劑A1的配制：
使用前將A1粉劑加1ml無水乙醇充分溶解2-8℃保存,。
2. 試劑A工作液配制：
使用前將配制好的試劑A1：A2按1:59的比例進行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用,；
3. 試劑B工作液配制：
使用前將粉劑B1加90~100℃的熱純水170ml,，充分溶解，將配制好的B1和B2兩種溶液充分混勻,，得到的為過飽和溶液,，室溫保存；如果出現(xiàn)結(jié)晶,，直接取上清進行實驗,；
4. 試劑C工作液配制：
加純水200ml，充分溶解后,，室溫保存,；可以保存在贈送的塑料瓶中。
5. 試劑D工作液配制：
加純水50ml,，充分溶解后,，2-8℃避光保存；
6. 試劑F工作液配制：
將試劑F：標準溶劑儲備液：純水=1:9的比例10倍稀釋,；
7. 標準品的配制：
1mmol/L的GSH標準溶液的配制：取3.07mg的GSH標準品一支加到已配好的試劑F工作液10ml中混勻溶解,；
20umol/L的GSH標準溶液的配制：取1mmol/L的GSH標準溶液0.2ml加試劑F工作液9.8ml中混勻溶解；
8. 基質(zhì)液的配制：
試劑A工作液與1mmol/L的GSH標準溶液以1:1混合,。

操作步驟：,；

(一)、樣本前處理
1. 50倍稀釋的溶血液的配制：取肝素抗凝全血20ul,，以純水稀釋至1ml,，混勻，放置5min進行測定,；配制好的溶血液要在1小時內(nèi)測定完,，否則影響酶活力；抗凝全血若當(dāng)天來不及測定可冰箱2-8℃保存,，2-3天內(nèi)酶活力變化不大,；
2. 組織勻漿的制備;
（1）取組織塊（0.2-1g）最少可到2-5mg，在冷的生理鹽水中漂洗,，去除血液,，擦拭干，稱重,，放入5或10ml的小燒杯中,；
（2）加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（ph7.4的0.01mol/L Tris-Hcl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化鈉溶液）或者用0.86%冷生理鹽水,，加入的體積總量為組織塊重量的9倍,。將組織塊盡可能的剪碎。
（3）機械勻漿：用組織搗碎機10000-15000r/min 上下研磨制成10%勻漿,。
（4）將制備好的10%勻漿用普通離心機或低溫低速離心機3000r/min左右離心10-15min,，取上清待測；
3. 線粒體及微粒體的制備：
（1）制備10%組織勻漿（制備方法同上）,；
（2）制備線粒體：取10%組織勻漿,，用普通離心機或低溫低速離心機以1000-2000r/min離心10min，取上清以8000-10000r/min（低溫高速離心機）離心15min,，沉淀即為線粒體,；
（3）制備微粒體：取分離線粒體后的上清液，以144000g離心30min,，沉淀為即為微粒體,；
（4）將分離的線粒體或微粒體分別用冰冷的勻漿介質(zhì)制備成混懸液，機械或手工勻漿使其破碎,，待測酶活力,；也可反復(fù)凍融使其破碎，但有部分酶活會受影響,。
4. 血清,、血漿可直接取樣；

（二）,、血清樣本操作表
計算公式：
1. 血清GST活力單位定義：
每毫升血清（漿）在37℃的反應(yīng)1min,，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃
度降低1umol/L為1個酶活力單位,；

2. 計算公式：

血清（漿）GST活力 = 對照OD值–測定OD值X 標準品濃度 X 反應(yīng)體系稀釋÷ 反應(yīng)時間
（U/ml） 標準OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍數(shù)（6倍） （30min）


÷ 樣本取樣量（0.1ml）

（二）,、組織樣本操作表
酶促反應(yīng)：
顯色反應(yīng)：
計算公式：
1. 組織樣本GST活力單位定義：
每毫克組織蛋白在37℃的反應(yīng)1min，扣除非酶促反應(yīng),，使反應(yīng)體系中GSH濃
度降低1umol/L為1個酶活力單位,；

2. 計算公式：

組織中GST活力 = 對照OD值–測定OD值X標準品濃度 X反應(yīng)體系稀釋÷反應(yīng)時間÷取樣量
（U/mgprot） 標準OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍數(shù)（6倍） （10min）（0.1ml）

÷ 待測樣本蛋白濃度
（mgprot/ml）

【注】：mgprot/ml表示蛋白濃度為毫克蛋白/毫升。

（三）50倍稀釋溶血液樣本檢測：
酶促反應(yīng)：
顯色反應(yīng)：

計算公式：
1. 全血中GST活力單位定義：
每毫升全血在37℃的反應(yīng)1min,，扣除非酶促反應(yīng),，使反應(yīng)體系中GSH濃
度降低1umol/L為1個酶活力單位；

2. 計算公式：

全血GST活力 = 對照OD值–測定OD值X 標準品濃度 X 反應(yīng)體系稀釋÷ 反應(yīng)時間
（U/ml） 標準OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍數(shù)（6倍）（30min）


÷ 全血取樣量（0.004ml）