01選擇熒光探針常用的熒光染料是DCFH-DA,，它能夠進入細胞并在細胞內(nèi)被酯酶水解成DCFH,。DCFH隨后可以被細胞內(nèi)的活性氧氧化，生成發(fā)熒光的DCF,。

02DCFH-DA是一種用于檢測活性氧ROS的熒光探針,，全稱為2,7-二氯熒光素二乙酸酯。其工作原理為：DCFH-DA本身沒有熒光,，但可以自由穿過細胞膜,，一旦進入細胞，它會被細胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH,，由于DCFH無法穿過細胞膜,，因此熒光探針會在細胞內(nèi)積聚。細胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH,，生成有熒光的DCF,，且熒光強度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡,、流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設備,，在最大激發(fā)波長480nm和最大發(fā)射波長525nm下檢測熒光信號。

03步驟裝載探針

對于刺激時間較短(通常為2小時以內(nèi))的細胞,，先裝載探針,，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞,，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞,，后裝載探針。

原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞,。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,，使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養(yǎng)液,，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA,。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升,。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘,。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA,。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

收集細胞后裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,，使終濃度為10微摩爾/升,。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升,，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘,。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下,，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次,，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA,。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞,。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。