總RNA柱式提取試劑盒

產(chǎn)品描述

總RNA柱式提取試劑盒可以快速從細(xì)胞,、細(xì)菌和部分動(dòng)物組織中提取高質(zhì)量的總RNA,，不使用酚和氯仿等有毒物質(zhì)。試劑盒中裂解液（Lysis Buffer）含有強(qiáng)變性劑和RNA酶抑制劑,，能夠迅速裂解樣品并失活RNA酶,，確保操作過程中RNA的完整性。提取得到的總RNA可用于RT-PCR,、qPCR,、Northern blotting、cDNA文庫構(gòu)建等多種實(shí)驗(yàn),。整個(gè)提取過程僅需10 min,，操作簡(jiǎn)單快速、穩(wěn)定性高,。

本試劑盒僅適用于部分組織類型,，包括肝臟、腸、腦,、脾臟和柔軟的腫瘤組織，不適用于肺,、心臟,、皮膚、骨骼,、肌肉等堅(jiān)韌的組織,。

訂購信息

產(chǎn)品組分

u  Wash Buffer使用前請(qǐng)加入48ml無水乙醇，搖勻后使用,。

運(yùn)輸與保存

常溫運(yùn)輸,。常溫保存，有效期12個(gè)月,。

使用方法

一,、 樣品裂解

1.       貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞

(1)       移除培養(yǎng)基，PBS洗一次,；

(2)       在培養(yǎng)板中加入500 μL的Lysis Buffer (＜3x10⁶個(gè)細(xì)胞),，水平放置片刻，再用槍頭吹吸或攪拌數(shù)次,，直至細(xì)胞裂解,。轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，用力反復(fù)吹打數(shù)次,，充分裂解直到看不到細(xì)胞團(tuán)為止,，然后進(jìn)行步驟二；

注：(1) 細(xì)胞樣品建議用6孔板或35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞,，培養(yǎng)至合適的密度進(jìn)行 RNA提取 (24孔板培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)至90%以上的細(xì)胞密度也可使用),。 (2) 不方便直接裂解的培養(yǎng)容器，可以使用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞或者胰酶消化后,，將細(xì)胞收集到離心管中,。 (3) 對(duì)于T細(xì)胞/B細(xì)胞等體積很小、RNA含量很低的細(xì)胞,，建議增加細(xì)胞數(shù)到至少1x10⁶以上,。

2.       懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞

(1)       取1~3x10⁶個(gè)細(xì)胞的懸液至1.5 mL離心管，1000 g離心1 min收集細(xì)胞,；

(2)       去上清,，加入500 μL的Lysis Buffer，用力吹吸10次,，vortex 10 s,，保證細(xì)胞裂解，看不到細(xì)胞團(tuán)，然后進(jìn)行步驟二,。

3.       細(xì)菌細(xì)胞

5,000 rpm離心3 min收集適量的菌體(＜5x10⁸),，棄去上清，加入100μL含有溶菌酶的TE buffer,，吹打混勻,，室溫靜置孵育數(shù)分鐘。加入500 μL的Lysis Buffer,，劇烈振蕩20 s,，12,000rpm離心1~2 min，取上清,，然后進(jìn)行步驟二,。

4.       動(dòng)物組織（適合腸、肝,、腦,、脾、腫瘤,，不適用肺,、心、皮膚等堅(jiān)硬組織）

(1)       勻漿器勻漿：切取新鮮組織10~50mg至1.5 mL離心管中,，加入500 μL的Lysis Buffer,，用組織勻漿機(jī)勻漿組織，直至無肉眼可見的組織塊,。12,000 rpm離心1~2 min,。

(2)       或液氮研磨：在液氮中將10~50mg組織充分研磨，將研磨成粉的樣品轉(zhuǎn)移至離心管中,，加入加入500 μL的Lysis Buffer,，劇烈振蕩20 s，12,000rpm離心1~2 min,。

(3)       轉(zhuǎn)移不超過400μL上清至新離心管中,。

二、RNA提取

1.       細(xì)胞樣品

較精確估計(jì)裂解液體積,，向細(xì)胞裂解液中加入等體積的無水乙醇,，將離心管劇烈顛倒幾次，或用移液器用力吹吸數(shù)次,，充分混勻,，然后將液體轉(zhuǎn)移至離心柱上，進(jìn)行步驟3,。注：可能會(huì)產(chǎn)生沉淀,這是正?，F(xiàn)象,，不影響提取過程，繼續(xù)后續(xù)操作,。

2.       組織樣本

較精確估計(jì)裂解液體積,，向裂解液中加入0.5倍體積的無水乙醇（或等體積的70%乙醇），將離心管劇烈顛倒幾次,，或用移液器用力吹吸數(shù)次,，充分混勻，然后將液體轉(zhuǎn)移至離心柱上,。

3.       7,000 rpm離心1 min（如離心柱上仍有液體殘留可增加轉(zhuǎn)速至12,000 rpm）,棄廢液。

4.       向RNA柱中加入500 μL的Wash Buffer,，12,000 rpm離心1 min,。

5.       倒掉廢液，將RNA柱裝回收集管,，12,000 rpm空管離心1 min,，去除殘留的Wash Buffer。

6.       取出RNA吸附柱,，放入一個(gè)RNase-free的1.5mL離心管中,，開蓋晾干1 min。向RNA柱的膜中心部位加入25~50uL的Elution buffer,，室溫靜置1 min,。

7.       12,000 rpm離心1 min。樣品可長期保存至-80℃,。注：加洗脫液體積不應(yīng)少于25uL,，否則會(huì)影響回收率，為了獲得更大濃度的RNA,，可將離心的RNA溶液重新加入到吸附柱,，重復(fù)洗脫一遍。

注意事項(xiàng)

1.     本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用,，不得用于臨床診斷,、治療等領(lǐng)域。

2.     加入Lysis Buffer后,，一定要充分振蕩,，保證RNA提取的效果；如果混合液非常粘稠難以轉(zhuǎn)移,，明顯樣品量過多,，增加Lysis buffer用量或減少樣本用量。

3.     細(xì)胞或組織裂解產(chǎn)物,，上柱前需要加入無水乙醇,，充分混勻之后加入離心柱離心,。

4.     使用的樣本避免反復(fù)凍融，以免影響RNA的產(chǎn)率和質(zhì)量,。

5.     關(guān)于RNA純度：OD260/OD280和OD260/OD230比值是衡量RNA純度的指標(biāo), 高質(zhì)量的RNA,，OD260/OD280的值在1.9-2.2之間，OD260/OD230大于1.8（比較純凈的比值大于2.0）,。本試劑盒提取RNA,使用Nanodrop等微量分光光度計(jì)測(cè)定OD 260/280在1.90~2.2之間,，OD260/230在2.0~2.2之間均屬正常。

6.     關(guān)于DNA微量殘留：在總RNA提取過程中,，通常無法避免基因組DNA的微量殘留,。使用本試劑盒，由于結(jié)合了的緩沖液體系和高特異性吸附膜,，獲得的總RNA中DNA殘留量較少,，對(duì)大多數(shù)qPCR擴(kuò)增過程影響不大。如果實(shí)驗(yàn)對(duì)基因組DNA殘留較為敏感,，建議采取以下措施：①DNase I 處理：在后續(xù)步驟中使用DNase I 酶消化基因組DNA,。②優(yōu)化引物設(shè)計(jì)：選擇跨內(nèi)含子的引物或設(shè)計(jì)在基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增產(chǎn)物大小不同的引物對(duì)，以避免DNA作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng),。