實驗概念

將目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件構建入帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達載體,，構建成報告基因質(zhì)粒,，使這段序列調(diào)控luciferase的轉(zhuǎn)錄表達,。然后將報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,，給予其不同的處理后裂解細胞,，并加入底物熒光素(luciferin),，luciferase可催化luciferin發(fā)出熒光(強波長在560nm左右)。檢測得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對該轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件的影響,。為避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞時效率差異所造成的誤差，通常會轉(zhuǎn)入Renilla luciferase的報告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參(強波長在465nm左右),，即雙熒光報告系統(tǒng)。

實驗流程

（1） 用生物信息學方法分析并預測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結合位點,。

（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段,，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中,。

（3）篩選陽性克隆,，測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用,。

（4） 擴增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒,，提純備用,。同時準備相應的空載質(zhì)粒對照，提純備用,。

（5） 培養(yǎng)293（或其它目的細胞）,，并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）,。

（6） 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。

（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測,。

（8） 加入底物,，測定熒光素酶的活性。

（9） 計算相對熒光強度,，并與空載對照比較。

注意事項：需提前告知相關的基因信息,，如名稱、序列,、ID等