大腸桿菌表達(dá)載體要求：①有一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子及其兩側(cè)的調(diào)控序列；②應(yīng)有SD序列，且SD序列與起始密碼子ATG之間要有合適的距離,；③在克隆基因與啟動(dòng)子之間有正確的閱讀框架,；④外源基因下游應(yīng)加入不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。

構(gòu)建好表達(dá)載體之后,，提取重組載體的質(zhì)粒,，然后用質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)宿主菌的轉(zhuǎn)化。

NCBI上查找目的基因SD序列,，使用Primer 5軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì),，在設(shè)計(jì)引物時(shí)須引入合適的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，具體可查看本公眾號(hào)分享的引物設(shè)計(jì),。

1.2 PCR擴(kuò)增（以Q5酶擴(kuò)增為例）

PCR體系（25 μl）：

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

      根據(jù)目的條帶大小配置相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠,，微波爐加熱，全部溶解后,，冷卻至60℃左右,，按照1：10000加入核酸染料，混勻后倒入凝膠鑄槽中,，插入梳子,，除去氣泡，待全部凝固后拔出梳子,。

將凝膠置于電泳槽中,，加樣孔放置于負(fù)極，進(jìn)行加樣（選取合適的DNA Marker）,，根據(jù)DNA Marker指示條帶在凝膠上的位置決定電泳是否終止,，然后將凝膠放置在凝膠成像儀中切膠回收。

2.目的片段和表達(dá)載體的連接（以T4連接為例）

    不同的表達(dá)載體具有不同的優(yōu)勢(shì),，在分析基因序列之后可以選擇最佳的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建,。因科研需求，需要pET系列,、pGEX系列,、pCold(BL21分子伴侶)系列等原核表達(dá)載體。

b. 連接載體酶切：37℃ 1 h

3.目的蛋白的表達(dá)

3.1 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒

a.從-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞,，放在冰上融化；

b.將10μL連接產(chǎn)物全部加入到50 μL感受態(tài)細(xì)胞中,，輕輕混勻,，冰浴30 min；

c.將EP管放在42℃熱激1 min 30 s,，速置冰中3 min,；

d.向EP管中加入440 μL無(wú)抗的液體LB，置于搖床上37℃220 rpm培養(yǎng)1 h,；

e.取適量活化后菌液均勻涂布于含抗性（與載體上抗性基因一致）的固體LB培養(yǎng)基上,，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置12-16 h；

f.轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒,，經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后進(jìn)行后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn),。

3.2 提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21

a.將鑒定正確的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞（和轉(zhuǎn)化同理）；

b.挑取單菌落接種至含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中,，置于搖床上37 ℃ 220 rpm培養(yǎng)過(guò)夜,；

c.將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液以1:100的比例接種于含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)；

d.待OD600=0.6-0.8時(shí),，取1mL菌液作為未誘導(dǎo)全菌樣品對(duì)比,，并向剩余菌液中加入終濃度為0.5 mM的IPTG，置于搖床上低溫180 rpm誘導(dǎo)過(guò)夜,。

3.3 超聲破碎菌液

a.從過(guò)夜誘導(dǎo)后的菌液中取1mL作為誘導(dǎo)后全菌樣品對(duì)比,，收集剩余菌液離心（8000 rpm，20 min,，4℃）棄上清用PBS重懸濃縮（濃縮比例約10:1）,；

b.超聲破碎（超聲4 s，停歇7 s）至透亮,，結(jié)束后離心（10000 rpm,，30min，4℃）分別收集上清和沉淀,，將其作對(duì)照組取樣,；

c.取誘導(dǎo)前全菌，誘導(dǎo)后全菌,，誘導(dǎo)后上清，誘導(dǎo)后沉淀各40μL,，加入10 μL 5×loading buffer,，于99℃變性20min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,。

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