大腸桿菌表達載體要求：①有一個強的啟動子及其兩側的調(diào)控序列,；②應有SD序列，且SD序列與起始密碼子ATG之間要有合適的距離,；③在克隆基因與啟動子之間有正確的閱讀框架,；④外源基因下游應加入不依賴ρ因子的轉錄終止區(qū)。

構建好表達載體之后,，提取重組載體的質粒,，然后用質粒進行表達宿主菌的轉化。

NCBI上查找目的基因SD序列,，使用Primer 5軟件進行引物的設計,，在設計引物時須引入合適的酶切位點和保護性堿基，具體可查看本公眾號分享的引物設計,。

1.2 PCR擴增（以Q5酶擴增為例）

PCR體系（25 μl）：

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

      根據(jù)目的條帶大小配置相應濃度的瓊脂糖凝膠,，微波爐加熱，全部溶解后,，冷卻至60℃左右,，按照1：10000加入核酸染料，混勻后倒入凝膠鑄槽中,，插入梳子,，除去氣泡，待全部凝固后拔出梳子,。

將凝膠置于電泳槽中,，加樣孔放置于負極，進行加樣（選取合適的DNA Marker）,，根據(jù)DNA Marker指示條帶在凝膠上的位置決定電泳是否終止,，然后將凝膠放置在凝膠成像儀中切膠回收。

2.目的片段和表達載體的連接（以T4連接為例）

    不同的表達載體具有不同的優(yōu)勢,，在分析基因序列之后可以選擇最佳的表達系統(tǒng)進行重組表達質粒構建,。因科研需求，需要pET系列,、pGEX系列,、pCold(BL21分子伴侶)系列等原核表達載體。

b. 連接載體酶切：37℃ 1 h

3.目的蛋白的表達

3.1 連接產(chǎn)物轉化并挑取陽性克隆質粒

a.從-80℃取出感受態(tài)細胞，放在冰上融化,；

b.將10μL連接產(chǎn)物全部加入到50 μL感受態(tài)細胞中,，輕輕混勻，冰浴30 min,；

c.將EP管放在42℃熱激1 min 30 s,，速置冰中3 min；

d.向EP管中加入440 μL無抗的液體LB,，置于搖床上37℃220 rpm培養(yǎng)1 h,；

e.取適量活化后菌液均勻涂布于含抗性（與載體上抗性基因一致）的固體LB培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置12-16 h,；

f.轉化后挑取陽性克隆質粒,，經(jīng)測序鑒定無誤后進行后續(xù)誘導表達實驗。

3.2 提取質粒轉化BL21

a.將鑒定正確的表達重組質粒轉化BL21感受態(tài)細胞（和轉化同理）,；

b.挑取單菌落接種至含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中,，置于搖床上37 ℃ 220 rpm培養(yǎng)過夜；

c.將過夜培養(yǎng)的菌液以1:100的比例接種于含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng),；

d.待OD600=0.6-0.8時,，取1mL菌液作為未誘導全菌樣品對比,，并向剩余菌液中加入終濃度為0.5 mM的IPTG，置于搖床上低溫180 rpm誘導過夜,。

3.3 超聲破碎菌液

a.從過夜誘導后的菌液中取1mL作為誘導后全菌樣品對比,，收集剩余菌液離心（8000 rpm，20 min,，4℃）棄上清用PBS重懸濃縮（濃縮比例約10:1）,；

b.超聲破碎（超聲4 s，停歇7 s）至透亮,，結束后離心（10000 rpm,，30min，4℃）分別收集上清和沉淀,，將其作對照組取樣,；

c.取誘導前全菌，誘導后全菌,，誘導后上清,，誘導后沉淀各40μL，加入10 μL 5×loading buffer,，于99℃變性20min,，進行SDS-PAGE電泳分析。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力,、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè),。總部設在廣東,，服務面向全國,。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售,、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司,，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學,、細胞生物學,、免疫學、信號傳導和神經(jīng)科學等領域的產(chǎn)品供應線,，在各個領域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質量穩(wěn)定的產(chǎn)品,，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品,、技術支持與服務,。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務。 專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持,，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴,，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學領域科研的老師和同仁,。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨,，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持,，隨時為客戶提供服務。