實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>
基因表達(dá)是生物學(xué)研究中的重要內(nèi)容之一,而基因表達(dá)載體則是基因表達(dá)研究中十分重要的工具。基因表達(dá)載體是一種能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)氲郊?xì)胞中并使其表達(dá)的DNA分子。在細(xì)胞內(nèi),,基因表達(dá)載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程將外源基因轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì),從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)原理:
表達(dá)載體是用來(lái)在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體,,原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒,表達(dá)載體除具有克隆載體所具有的性質(zhì)以外,,還應(yīng)具有表達(dá)元件(轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的DNA序列),。
大腸桿菌表達(dá)載體要求:①有一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子及其兩側(cè)的調(diào)控序列;②應(yīng)有SD序列,且SD序列與起始密碼子ATG之間要有合適的距離,;③在克隆基因與啟動(dòng)子之間有正確的閱讀框架,;④外源基因下游應(yīng)加入不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
構(gòu)建好表達(dá)載體之后,,提取重組載體的質(zhì)粒,,然后用質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)宿主菌的轉(zhuǎn)化。

實(shí)驗(yàn)步驟:
1.1引物設(shè)計(jì)
NCBI上查找目的基因SD序列,,使用Primer 5軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì),,在設(shè)計(jì)引物時(shí)須引入合適的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基,具體可查看本公眾號(hào)分享的引物設(shè)計(jì),。
1.2 PCR擴(kuò)增(以Q5酶擴(kuò)增為例)
PCR體系(25 μl):

2.目的片段和表達(dá)載體的連接(以T4連接為例)
PCR程序:

1.3 瓊脂糖凝膠電泳
根據(jù)目的條帶大小配置相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠,,微波爐加熱,全部溶解后,,冷卻至60℃左右,,按照1:10000加入核酸染料,混勻后倒入凝膠鑄槽中,,插入梳子,,除去氣泡,待全部凝固后拔出梳子,。
將凝膠置于電泳槽中,,加樣孔放置于負(fù)極,進(jìn)行加樣(選取合適的DNA Marker),,根據(jù)DNA Marker指示條帶在凝膠上的位置決定電泳是否終止,,然后將凝膠放置在凝膠成像儀中切膠回收。
2.目的片段和表達(dá)載體的連接(以T4連接為例)
不同的表達(dá)載體具有不同的優(yōu)勢(shì),,在分析基因序列之后可以選擇最佳的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建,。因科研需求,需要pET系列,、pGEX系列,、pCold(BL21分子伴侶)系列等原核表達(dá)載體。
2.1 載體及PCR產(chǎn)物雙酶切
選擇合適的酶切位點(diǎn),,對(duì)目的片段和表達(dá)載體進(jìn)行酶切反應(yīng),。
a. 膠回收產(chǎn)物酶切:37℃ 1 h

b. 連接載體酶切:37℃ 1 h

酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳,UVP觀察,,用刀片切下目的條帶,,參照膠回收試劑盒說(shuō)明書回收目的片段。
2.2 連接反應(yīng)
將膠回收得到的酶切PCR產(chǎn)物和酶切載體進(jìn)行連接,,T4 DNA ligase 16/4℃過(guò)夜,,連接體系如下:

3.目的蛋白的表達(dá)
3.1 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒
a.從-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞,,放在冰上融化;
b.將10μL連接產(chǎn)物全部加入到50 μL感受態(tài)細(xì)胞中,,輕輕混勻,,冰浴30 min;
c.將EP管放在42℃熱激1 min 30 s,,速置冰中3 min,;
d.向EP管中加入440 μL無(wú)抗的液體LB,置于搖床上37℃220 rpm培養(yǎng)1 h,;
e.取適量活化后菌液均勻涂布于含抗性(與載體上抗性基因一致)的固體LB培養(yǎng)基上,,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置12-16 h;
f.轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒,,經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后進(jìn)行后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn),。
3.2 提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21
a.將鑒定正確的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞(和轉(zhuǎn)化同理);
b.挑取單菌落接種至含抗性(與載體上抗性基因一致)的液體LB培養(yǎng)瓶中,,置于搖床上37 ℃ 220 rpm培養(yǎng)過(guò)夜,;
c.將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液以1:100的比例接種于含抗性(與載體上抗性基因一致)的液體LB培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng);
d.待OD600=0.6-0.8時(shí),,取1mL菌液作為未誘導(dǎo)全菌樣品對(duì)比,,并向剩余菌液中加入終濃度為0.5 mM的IPTG,置于搖床上低溫180 rpm誘導(dǎo)過(guò)夜,。
3.3 超聲破碎菌液
a.從過(guò)夜誘導(dǎo)后的菌液中取1mL作為誘導(dǎo)后全菌樣品對(duì)比,,收集剩余菌液離心(8000 rpm,20 min,,4℃)棄上清用PBS重懸濃縮(濃縮比例約10:1),;
b.超聲破碎(超聲4 s,停歇7 s)至透亮,,結(jié)束后離心(10000 rpm,,30min,4℃)分別收集上清和沉淀,,將其作對(duì)照組取樣,;
c.取誘導(dǎo)前全菌,誘導(dǎo)后全菌,,誘導(dǎo)后上清,誘導(dǎo)后沉淀各40μL,,加入10 μL 5×loading buffer,,于99℃變性20min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,。
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