產(chǎn)品簡(jiǎn)介

B-27是一種最常被引用的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)添加劑,，是一種優(yōu)化的無(wú)血清添加劑，用于支持胚胎,、出生后和成年海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）神經(jīng)元的生長(zhǎng)和活性維持,。B-27無(wú)血清添加劑以50倍工作液提供，可以與Neuronal 培養(yǎng)基組合使用,，用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)而無(wú)需再添加飼養(yǎng)層細(xì)胞,。在神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基中使用B-27添加劑，用于培養(yǎng)產(chǎn)前和胚胎神經(jīng)元,，以獲得優(yōu)化的活性和長(zhǎng)期的存活率,。

B-27 添加劑適用于大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng),，可用于神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及維持,，干細(xì)胞增殖與分化。

60711ES是B-27 supplement, serum free,50X B-27無(wú)血清添加劑,50X (非動(dòng)物源）,。

60712ES是B-27 supplement without Vitamin A, serum free,50X B-27無(wú)血清添加劑,去除維生素A,50X (非動(dòng)物源）,。60712ES去除了維生素A，可防止神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化,。

產(chǎn)品信息

組分信息

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃避光保存,，有效期2年,。

使用說(shuō)明

B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑是50×濃度。使用前請(qǐng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如Neurobasal)稀釋到1×,。如準(zhǔn)備50 mL培養(yǎng)基：將1 mL的B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑(50×)加入到49 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,。配置好的培養(yǎng)基，可于2~8℃避光保存1周,。

1. 培養(yǎng)基制備
   （1）置于4°C解凍本產(chǎn)品,。
   （2）在使用前無(wú)菌添加2%本產(chǎn)品和0.5 mM L-酰胺至神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配置成神經(jīng)元培養(yǎng)基（注：下文中出現(xiàn)的“神經(jīng)元培養(yǎng)基”即指此種添加了B-27添加劑和L-酰胺的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基）,。注意：剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積,，并儲(chǔ)存在-25~-20℃。在以后的試驗(yàn)中根據(jù)需要解凍相應(yīng)體積的本產(chǎn)品,。避免反復(fù)凍融,。
   （3）對(duì)于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，神經(jīng)元培養(yǎng)基（由前述步驟制備）需要額外補(bǔ)充25 μM的L-酸,，在培養(yǎng)的第4天以后的換液中應(yīng)不再添加酸,。配置好的培養(yǎng)基，可于2~8℃的避光保存1周,。
   2. 細(xì)胞培養(yǎng)步驟
   下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經(jīng)元,，以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中測(cè)試。
   （1）用無(wú)菌的冷的0.05 mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面(玻璃或細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)塑料),，每平方厘米表面使用0.15 mL,，在室溫下保溫1 h。
   （2）去除多聚賴氨酸溶液,，并用無(wú)菌蒸餾水沖洗兩次(須清洗,，因?yàn)槎嗑圪嚢彼釋?duì)細(xì)胞有毒性)。在超凈工作臺(tái)中打開(kāi)培養(yǎng)板的蓋子通風(fēng),，直到每個(gè)孔干燥,。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周。
   （3）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序或隨細(xì)胞提供的說(shuō)明書(shū)分離原代的大鼠神經(jīng)元或解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元,。
   （4）在預(yù)熱的(37°C)神經(jīng)元培養(yǎng)基中（如前所述的方法制備)接種細(xì)胞,，建議的細(xì)胞密度為160個(gè)細(xì)胞/mm2，或必要時(shí)使用自行優(yōu)化的細(xì)胞密度,。注意：對(duì)于海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)基中須添加25 μM L-酸,，參見(jiàn)“培養(yǎng)基的制備”,。
   （5）在36~38°C，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的,，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）,。
   （6）培養(yǎng)4~24 h后,，更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
   （7）對(duì)海馬神經(jīng)元以外的細(xì)胞：在接種4天后,，更換一半體積的新鮮的培養(yǎng)基，之后每三天重復(fù)一次,。對(duì)海馬神經(jīng)元：接種三天后,，用不含L-酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基，之后每三天重復(fù)一次,。注意：在培養(yǎng)基中添加25 µM ,，可改善海馬神經(jīng)元的長(zhǎng)期存活率。
   3. 分離原代大鼠胚胎神經(jīng)元
   下列程序推薦用于培養(yǎng)受精18天的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元,。
   （1）從受精18天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側(cè)海馬,。
   （2）在預(yù)置了培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置,，直到所有的組織都已解體,。
   （3）使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液,，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基,。
   （4） 在不含鈣離子的培養(yǎng)基中，使用2 mg/mL過(guò)濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液,，在30°C酶解組織大約30 min,，其間每5 min輕搖錐形管以幫助降解。每對(duì)海馬組織使用2 mL酶溶液,。
   （5）加入兩倍體積的培養(yǎng)基以恢復(fù)二價(jià)陽(yáng)離子的濃度,，停止酶解。
   （6）使未解離的組織沉降至管底（約2 min）,，然后把上清液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中,，以150×g離心5 min。
   （7）在1 mL神經(jīng)元培養(yǎng)基中重懸沉淀物,，取一小份(例如10 μL)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。后續(xù)的操作按照“復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元”的第8-10步驟進(jìn)行。
   4. 復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元
   重要提示：原代神經(jīng)元細(xì)胞將會(huì)貼附在裸露的塑料或玻璃表面,，建議事先用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內(nèi)表面,，以獲得最高的回收率和產(chǎn)量。由于細(xì)胞從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時(shí)極其脆弱,，請(qǐng)?jiān)谡麄€(gè)操作過(guò)程中不要震蕩或離心細(xì)胞,。我們建議每次只解凍一管細(xì)胞。務(wù)必減少?gòu)囊旱修D(zhuǎn)移凍存管到37°C水浴中的操作時(shí)間,。細(xì)胞從液氮罐到水浴的運(yùn)輸過(guò)程中,，可在冰桶中放少量液氮,，將細(xì)胞置于這個(gè)冰桶中來(lái)進(jìn)行。
   （1）在解凍細(xì)胞之前,，用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗無(wú)菌的15 mL錐形管,，然后在超凈工作臺(tái)中通風(fēng)晾干。
   （2）從液氮中取出凍存管時(shí)可稍微擰松管帽以釋放壓力,，然后再擰緊,。
   （3） 在37°C水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細(xì)胞（小于2 min）。當(dāng)觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時(shí)（觸摸凍存管仍然感覺(jué)是冷的）從水浴中取出,。
   （4）在超凈工作臺(tái)中用70%的異丙醇消毒凍存管,。在工作臺(tái)臺(tái)面上輕敲凍存管以使管內(nèi)液體沉降到管底。
   （5）使用事先用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗并干燥過(guò)的1 mL吸頭極其輕柔地將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到事先沖洗并干燥的15 mL錐形管中,。
   （6）用1 mL預(yù)熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管,，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到15 mL錐形管中的細(xì)胞里。每加一滴都輕柔地轉(zhuǎn)動(dòng)錐形管一次,。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中,。
   （7）慢慢地逐滴加入另外2 mL預(yù)熱的培養(yǎng)基，使管內(nèi)的液體體積為4 mL,。用1 mL吸頭輕柔地混合液體,，注意不要造成任何氣泡。
   （8）用一個(gè)事先沖洗干燥過(guò)的吸頭吸取10 μL細(xì)胞懸液加入到含有10 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)的微量離心管中,，輕敲管壁以混勻溶液,。使用手動(dòng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法測(cè)定活細(xì)胞密度。解凍的細(xì)胞的活率應(yīng)超過(guò)50%,。
   （9）在已經(jīng)事先用多聚賴氨酸包被（參見(jiàn)“細(xì)胞培養(yǎng)步驟”）的48孔板中每孔中接種大約1×105個(gè)細(xì)胞或按所需的細(xì)胞密度接種,。加入預(yù)熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋到每孔500 μL。
   （10）按照“細(xì)胞培養(yǎng)步驟”中的5-6步驟進(jìn)行神經(jīng)元的培養(yǎng),。在36~38°C,，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）,。

注意事項(xiàng)

1. 為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 避免反復(fù)凍融,，應(yīng)及時(shí)分裝,，最好在４℃下過(guò)夜融化，稀釋時(shí)要求在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行,。