產(chǎn)品簡介

B-27是一種最常被引用的神經(jīng)細胞培養(yǎng)添加劑,，是一種優(yōu)化的無血清添加劑，用于支持胚胎,、出生后和成年海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）神經(jīng)元的生長和活性維持,。B-27無血清添加劑以50倍工作液提供,，可以與Neuronal 培養(yǎng)基組合使用，用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)而無需再添加飼養(yǎng)層細胞,。在神經(jīng)元基礎培養(yǎng)基中使用B-27添加劑,，用于培養(yǎng)產(chǎn)前和胚胎神經(jīng)元，以獲得優(yōu)化的活性和長期的存活率,。

B-27 添加劑適用于大多數(shù)神經(jīng)細胞培養(yǎng),，無血清細胞培養(yǎng)，可用于神經(jīng)細胞生長及維持,，干細胞增殖與分化,。

60711ES是B-27 supplement, serum free,50X B-27無血清添加劑,50X (非動物源）。

60712ES是B-27 supplement without Vitamin A, serum free,50X B-27無血清添加劑,去除維生素A,50X (非動物源）,。60712ES去除了維生素A,，可防止神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞分化。

產(chǎn)品信息

組分信息

儲存條件

-25~-15℃避光保存,，有效期2年,。

使用說明

B27細胞培養(yǎng)添加劑是50×濃度。使用前請用基礎培養(yǎng)基(如Neurobasal)稀釋到1×,。如準備50 mL培養(yǎng)基：將1 mL的B27細胞培養(yǎng)添加劑(50×)加入到49 mL的基礎培養(yǎng)基中,。配置好的培養(yǎng)基，可于2~8℃避光保存1周,。

1. 培養(yǎng)基制備
   （1）置于4°C解凍本產(chǎn)品。
   （2）在使用前無菌添加2%本產(chǎn)品和0.5 mM L-酰胺至神經(jīng)元基礎培養(yǎng)基,，配置成神經(jīng)元培養(yǎng)基（注：下文中出現(xiàn)的“神經(jīng)元培養(yǎng)基”即指此種添加了B-27添加劑和L-酰胺的神經(jīng)元基礎培養(yǎng)基）,。注意：剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積，并儲存在-25~-20℃,。在以后的試驗中根據(jù)需要解凍相應體積的本產(chǎn)品,。避免反復凍融。
   （3）對于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng),，神經(jīng)元培養(yǎng)基（由前述步驟制備）需要額外補充25 μM的L-酸,，在培養(yǎng)的第4天以后的換液中應不再添加酸。配置好的培養(yǎng)基,，可于2~8℃的避光保存1周,。
   2. 細胞培養(yǎng)步驟
   下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經(jīng)元，以及神經(jīng)母細胞瘤細胞系中測試,。
   （1）用無菌的冷的0.05 mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面(玻璃或細胞培養(yǎng)級塑料),，每平方厘米表面使用0.15 mL，在室溫下保溫1 h,。
   （2）去除多聚賴氨酸溶液,，并用無菌蒸餾水沖洗兩次(須清洗,，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性)。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)板的蓋子通風,，直到每個孔干燥,。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周。
   （3）根據(jù)標準實驗室程序或隨細胞提供的說明書分離原代的大鼠神經(jīng)元或解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元,。
   （4）在預熱的(37°C)神經(jīng)元培養(yǎng)基中（如前所述的方法制備)接種細胞,，建議的細胞密度為160個細胞/mm2，或必要時使用自行優(yōu)化的細胞密度,。注意：對于海馬神經(jīng)元,，培養(yǎng)基中須添加25 μM L-酸，參見“培養(yǎng)基的制備”,。
   （5）在36~38°C,，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）,。
   （6）培養(yǎng)4~24 h后,，更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
   （7）對海馬神經(jīng)元以外的細胞：在接種4天后,，更換一半體積的新鮮的培養(yǎng)基，之后每三天重復一次,。對海馬神經(jīng)元：接種三天后,，用不含L-酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基，之后每三天重復一次,。注意：在培養(yǎng)基中添加25 µM ,，可改善海馬神經(jīng)元的長期存活率。
   3. 分離原代大鼠胚胎神經(jīng)元
   下列程序推薦用于培養(yǎng)受精18天的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元,。
   （1）從受精18天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側海馬,。
   （2）在預置了培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置,，直到所有的組織都已解體,。
   （3）使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液,，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基,。
   （4） 在不含鈣離子的培養(yǎng)基中，使用2 mg/mL過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液,，在30°C酶解組織大約30 min,，其間每5 min輕搖錐形管以幫助降解。每對海馬組織使用2 mL酶溶液。
   （5）加入兩倍體積的培養(yǎng)基以恢復二價陽離子的濃度,，停止酶解,。
   （6）使未解離的組織沉降至管底（約2 min），然后把上清液轉移到15 mL離心管中,，以150×g離心5 min,。
   （7）在1 mL神經(jīng)元培養(yǎng)基中重懸沉淀物，取一小份(例如10 μL)進行細胞計數(shù),。后續(xù)的操作按照“復蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元”的第8-10步驟進行,。
   4. 復蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元
   重要提示：原代神經(jīng)元細胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面，建議事先用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內(nèi)表面,，以獲得最高的回收率和產(chǎn)量,。由于細胞從凍存狀態(tài)復蘇時極其脆弱，請在整個操作過程中不要震蕩或離心細胞,。我們建議每次只解凍一管細胞,。務必減少從液氮中轉移凍存管到37°C水浴中的操作時間。細胞從液氮罐到水浴的運輸過程中,，可在冰桶中放少量液氮,，將細胞置于這個冰桶中來進行。
   （1）在解凍細胞之前,，用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗無菌的15 mL錐形管,，然后在超凈工作臺中通風晾干。
   （2）從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力,，然后再擰緊,。
   （3） 在37°C水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細胞（小于2 min）。當觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時（觸摸凍存管仍然感覺是冷的）從水浴中取出,。
   （4）在超凈工作臺中用70%的異丙醇消毒凍存管,。在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內(nèi)液體沉降到管底。
   （5）使用事先用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗并干燥過的1 mL吸頭極其輕柔地將細胞轉移到事先沖洗并干燥的15 mL錐形管中,。
   （6）用1 mL預熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到15 mL錐形管中的細胞里,。每加一滴都輕柔地轉動錐形管一次,。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中。
   （7）慢慢地逐滴加入另外2 mL預熱的培養(yǎng)基,，使管內(nèi)的液體體積為4 mL,。用1 mL吸頭輕柔地混合液體，注意不要造成任何氣泡,。
   （8）用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取10 μL細胞懸液加入到含有10 μL 0.4%臺盼藍的微量離心管中,，輕敲管壁以混勻溶液。使用手動的細胞計數(shù)方法測定活細胞密度,。解凍的細胞的活率應超過50%,。
   （9）在已經(jīng)事先用多聚賴氨酸包被（參見“細胞培養(yǎng)步驟”）的48孔板中每孔中接種大約1×105個細胞或按所需的細胞密度接種,。加入預熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋到每孔500 μL。
   （10）按照“細胞培養(yǎng)步驟”中的5-6步驟進行神經(jīng)元的培養(yǎng),。在36~38°C,，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）,。

注意事項

1. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 避免反復凍融,，應及時分裝,，最好在４℃下過夜融化，稀釋時要求在無菌環(huán)境中進行,。