自1986年di一個單抗藥物Ortholone OTK3上市，單抗藥物經(jīng)歷了鼠源,、嵌合,、人源化及全人源的發(fā)展歷程。但自始至終,，藥物的單克隆性都是作為治療性單抗的第一要素,。

　　生物工藝技術(shù)服務(wù)作為單抗的生產(chǎn)者，細(xì)胞株的單克隆源性就成為了單抗藥物研發(fā),、生產(chǎn)的重中之重,，是產(chǎn)品表達(dá)和質(zhì)量均一性的前提和保證。隨著30多年來的單抗藥物開發(fā)技術(shù)及工具的不斷發(fā)展,，各國的FDA對細(xì)胞單克隆源性的規(guī)則和細(xì)節(jié)要求在不斷提高,。

　　1、2011年以前,，一般只需要兩輪的傳統(tǒng)稀釋即可,。對代替手工分選或鋪板的設(shè)備，則主要關(guān)注這些工具的具體應(yīng)用流程和如何考察單克隆概率等,。

　　2,、在2012年，針對有限稀釋法,，提出需額外提供泊松分布數(shù)據(jù)來證明所采用的有限稀釋法所得到單克隆的細(xì)胞株的統(tǒng)計學(xué)概率,。

　　3,、2013年，明確提出必須確認(rèn)WCB的單克隆源性,。

　　4,、2014年有FDA官員建議，借助成像方式來證明細(xì)胞的單克隆性,，可允許一輪的有限稀釋,。隨著單克隆成像儀的不斷應(yīng)用于細(xì)胞系開發(fā)，F(xiàn)DA的官員也充分認(rèn)識到該技術(shù)的可靠性及嚴(yán)謹(jǐn)性,。

　　5,、從2016年至今，單克隆成像配合有限稀釋法或者高效鋪板設(shè)備實現(xiàn)細(xì)胞株的開發(fā)的技術(shù)路線已成為全球眾多藥企的基本工藝方法,。

　　為保證細(xì)胞株的生物工藝技術(shù)服務(wù),，一般會采用以下方法：

　　（1）兩輪有限稀釋,。根據(jù)泊松分布的原理計算,，按照低于0.5 cells/well進(jìn)行兩輪優(yōu)先稀釋，理論單克隆率在95%以上,，但是需要注意的是,，有限稀釋法得到的單克隆是沒辦法證明為單克隆的，只能推定為單克??；

　　（2）一輪有限稀釋或者單細(xì)胞鋪板設(shè)備搭配單克隆成像設(shè)備,。不同于概率計算和統(tǒng)計,，這個方法可以提供單克隆源性的影像數(shù)據(jù)，但同時面臨一定的挑戰(zhàn),。首先,，需要考量細(xì)胞是否沉底，落孔后細(xì)胞的位置等,；其次，成像設(shè)備的孔位校準(zhǔn),、微孔板底聚焦,、光源、鏡頭位移,、分辨率等都會影響圖像的準(zhǔn)確性和有效性,。

　　因此，在項目開展前對單細(xì)胞鋪板以及單克隆成像的整套細(xì)胞株構(gòu)建工藝流程的可靠性進(jìn)行一定的方法學(xué)驗證是非常有必要的,。

　　從研發(fā)的細(xì)胞株工藝平臺搭建方面,，單克隆源性方法學(xué)驗證后的流程更可控,，確立好的SOP更易于執(zhí)行，極大地降低工藝開發(fā)的潛在風(fēng)險,；當(dāng)項目走到申報階段,，方法學(xué)驗證后的單克隆成像圖片嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)，挑戰(zhàn)更小,，結(jié)合細(xì)胞庫均一性驗證的證明,，達(dá)到雙重保險的目的，確保項目申報的細(xì)胞株構(gòu)建環(huán)節(jié)的內(nèi)容順利和快速的通過,。

　　如何進(jìn)行單克隆源性的方法學(xué)驗證：

　　方法學(xué)驗證需要基于每個公司的現(xiàn)有工藝平臺,，如果選擇的工藝路線是兩輪有限稀釋，那么可以根據(jù)實際結(jié)果結(jié)合泊松分布來推算鋪板密度的合理性,。如果選擇一輪有限稀釋或者單細(xì)胞鋪板設(shè)備搭配單克隆成像設(shè)備,，那么就需要考慮鋪板后細(xì)胞沉底條件、細(xì)胞在孔板中位置以及單克隆成像設(shè)備對單克隆的識別能力,。此外,，基于單克隆鋪板設(shè)備的工藝平臺，還需要考量和評估不同項目的交叉污染風(fēng)險,。

　　單克隆驗證服務(wù)的方法學(xué)驗證核心步驟：

　　細(xì)胞自然沉降工藝驗證采用明場成像,，考察工藝平臺的宿主細(xì)胞在平臺沉降時間內(nèi)是否可以沉降，以及不同時間點沉降的效果,。

　　離心沉降工藝驗證采用明場成像,，考察平臺宿主細(xì)胞在平臺離心條件下是否可以沉降，以及離心后不同時間點沉降的效果,。

　　細(xì)胞識別驗證采用明場和熒光場成像,，考察成像設(shè)備對單克隆的識別情況。

　　單克隆鋪板設(shè)備項目交叉驗證采用明場和熒光場成像,，考察不同項目間單克隆鋪板設(shè)備是否有細(xì)胞株交叉現(xiàn)象,。

　　關(guān)于單克隆方法學(xué)驗證的實驗細(xì)節(jié)，歡迎聯(lián)系我們進(jìn)行咨詢,。