自1986年di一個單抗藥物Ortholone OTK3上市,，單抗藥物經(jīng)歷了鼠源、嵌合,、人源化及全人源的發(fā)展歷程,。但自始至終，藥物的單克隆性都是作為治療性單抗的第一要素,。

　　作為單抗的生產(chǎn)者,，細胞株的單克隆源性就成為了單抗藥物研發(fā)、生產(chǎn)的重中之重,，是產(chǎn)品表達和質量均一性的前提和保證,。隨著30多年來的單抗藥物開發(fā)技術及工具的不斷發(fā)展，各國的FDA對細胞單克隆源性的規(guī)則和細節(jié)要求在不斷提高,。

　　1,、2011年以前，一般只需要兩輪的傳統(tǒng)稀釋即可,。對代替手工分選或鋪板的設備,，則主要關注這些工具的具體應用流程和如何考察單克隆概率等。

　　2,、在2012年,，針對有限稀釋法，提出需額外提供泊松分布數(shù)據(jù)來證明所采用的有限稀釋法所得到單克隆的細胞株的統(tǒng)計學概率,。

　　3,、2013年，明確提出必須確認WCB的單克隆源性,。

　　4,、2014年有FDA官員建議，借助成像方式來證明細胞的單克隆性,，可允許一輪的有限稀釋,。隨著單克隆成像儀的不斷應用于細胞系開發(fā)，F(xiàn)DA的官員也充分認識到該技術的可靠性及嚴謹性,。

　　5,、從2016年至今,，單克隆成像配合有限稀釋法或者高效鋪板設備實現(xiàn)細胞株的開發(fā)的技術路線已成為全球眾多藥企的基本工藝方法。

　　為保證細胞株的單克隆驗證服務,，一般會采用以下方法：

　?。?）兩輪有限稀釋。根據(jù)泊松分布的原理計算,，按照低于0.5 cells/well進行兩輪優(yōu)先稀釋,，理論單克隆率在95%以上，但是需要注意的是,，有限稀釋法得到的單克隆是沒辦法證明為單克隆的,，只能推定為單克隆,；

　?。?）一輪有限稀釋或者單細胞鋪板設備搭配單克隆成像設備。不同于概率計算和統(tǒng)計,，這個方法可以提供單克隆源性的影像數(shù)據(jù),，但同時面臨一定的挑戰(zhàn)。首先,，需要考量細胞是否沉底,，落孔后細胞的位置等；其次,，成像設備的孔位校準,、微孔板底聚焦、光源,、鏡頭位移,、分辨率等都會影響圖像的準確性和有效性。

　　因此,，在項目開展前對單細胞鋪板以及單克隆成像的整套細胞株構建工藝流程的可靠性進行一定的方法學驗證是非常有必要的。

　　從研發(fā)的細胞株工藝平臺搭建方面,，單克隆源性方法學驗證后的流程更可控,，確立好的SOP更易于執(zhí)行，極大地降低工藝開發(fā)的潛在風險,；當項目走到申報階段,，方法學驗證后的單克隆成像圖片嚴謹科學，挑戰(zhàn)更小,，結合細胞庫均一性驗證的證明,，達到雙重保險的目的，確保項目申報的細胞株構建環(huán)節(jié)的內(nèi)容順利和快速的通過,。

　　如何進行單克隆源性的方法學驗證：

　　方法學驗證需要基于每個公司的現(xiàn)有工藝平臺,，如果選擇的工藝路線是兩輪有限稀釋,，那么可以根據(jù)實際結果結合泊松分布來推算鋪板密度的合理性。如果選擇一輪有限稀釋或者單細胞鋪板設備搭配單克隆成像設備,，那么就需要考慮鋪板后細胞沉底條件,、細胞在孔板中位置以及單克隆成像設備對單克隆的識別能力。此外,，基于單克隆鋪板設備的工藝平臺,，還需要考量和評估不同項目的交叉污染風險。

　　單克隆驗證服務的方法學驗證核心步驟：

　　細胞自然沉降工藝驗證采用明場成像,，考察工藝平臺的宿主細胞在平臺沉降時間內(nèi)是否可以沉降,，以及不同時間點沉降的效果。

　　離心沉降工藝驗證采用明場成像,，考察平臺宿主細胞在平臺離心條件下是否可以沉降,，以及離心后不同時間點沉降的效果。

　　細胞識別驗證采用明場和熒光場成像,，考察成像設備對單克隆的識別情況,。

　　單克隆鋪板設備項目交叉驗證采用明場和熒光場成像，考察不同項目間單克隆鋪板設備是否有細胞株交叉現(xiàn)象,。

　　關于單克隆方法學驗證的實驗細節(jié),，歡迎聯(lián)系我們進行咨詢。