基因敲除原理 我們是利用CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng),，CRISPR是一種來源于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的基因編輯技術(shù),，能精確識別靶細(xì)胞DNA片段中靶點的核苷酸序列，利用核酸內(nèi)切酶蛋白對DNA靶點序列進行切割,，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂,，斷裂將在體內(nèi)被細(xì)胞修復(fù)機制修復(fù)，其中,，非同源末端連接NHEJ這種修復(fù)將產(chǎn)生短的核酸插入或刪除,，其帶來的基因移碼突變，將導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子,，從而完成對靶細(xì)胞DNA目的基因片段的敲除,。在PAM片段上游設(shè)計sgRNA后，通過構(gòu)建基因敲除載體,，結(jié)合慢病毒系統(tǒng)，可以實現(xiàn)外源基因的整合,，利用抗生素或熒光,，最終篩選出成功實現(xiàn)基因敲除的細(xì)胞。 CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)服務(wù)優(yōu)勢： （1）廣泛適用于哺乳動物細(xì)胞,，脫靶率更低 （2）提高轉(zhuǎn)染率,，減低細(xì)胞毒性，縮短實驗周期 基因敲除細(xì)胞株的項目流程： （1）項目評估（免費） （2）細(xì)胞抗生素敏感濃度摸索與單克隆形成驗證 （3）sgRNA設(shè)計與敲除載體構(gòu)建 （4）慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染 （5）陽性多克隆篩選 （6）陽性單克隆篩選 （7）敲除驗證 基因敲除服務(wù)周期：根據(jù)細(xì)胞生長特性與基因不同,，服務(wù)周期在5～10周不等,。 服務(wù)流程：                      客戶提供：靶細(xì)胞及其培養(yǎng)方案、基因名稱 交付標(biāo)準(zhǔn)：1×基因敲除陽性單克隆細(xì)胞株（復(fù)蘇）                   1×項目結(jié)題報告 服務(wù)保證： （1）項目啟動后,，密切跟進實驗進展,，每兩周進行一次項目進度匯報。 （2）項目結(jié)題報告包含sgRNA序列、實驗詳細(xì)記錄,、測序結(jié)果及分析等,，滿足客戶后期論證材料需求。 （3）基因敲除陽性單克隆均經(jīng)過靶標(biāo)片段T載體克隆測序驗證,，保證基因敲除,。 【案例分享】CRISPR/Cas9基因敲除細(xì)胞株構(gòu)建 1 抗生素敏感濃度摸索?? 將細(xì)胞如下圖1稀釋。給藥7天后,，棄培養(yǎng)液,，用臺盼藍染色2 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況,。確定細(xì)胞多克隆細(xì)胞篩選和單克隆細(xì)胞篩選濃度,。                                       圖1 抗性濃度摸索 2 單克隆形成驗證 細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋混勻后加入96孔板,，用封口膠將孔板封好,，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)48 h后每日觀察并記錄單克隆形成情況,。 3 靶標(biāo)基因sgRNA 設(shè)計 根據(jù)基因序列信息,，設(shè)計 sgRNA。 4 位點序列信息確認(rèn) PCR擴增（圖2）,，測序驗證基因序列,，以確定sgRNA區(qū)域有無SNP。                                 圖2 靶標(biāo)序列擴增 5 敲除載體構(gòu)建 退火,，連接,，轉(zhuǎn)化，涂板（LB/Amp）培養(yǎng),。 每個實驗組各挑取6個單克隆菌落,，于LB/ Amp培養(yǎng)基中擴增，提取質(zhì)粒,，瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒提取效果（圖3）,。                                             圖3 質(zhì)粒抽提 酶切驗證 ：取3個單克隆酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果（圖4）,。選擇2個樣品送樣測序,。                                圖4 單克隆酶切驗證 6 慢病毒包裝 敲除載體無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，病毒包裝,。 7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 配制梯度病毒稀釋液,，細(xì)胞于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。 8 陽性多克隆細(xì)胞株篩選 9 陽性單克隆細(xì)胞株篩選 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,，更換培養(yǎng)基,，篩選至對照組大部分細(xì)胞死亡,，實驗組細(xì)胞擴大培養(yǎng)，進行單克隆篩選,。幾天后挑選陽性單克隆進行擴增,，并取樣驗證。  10 陽性單克隆細(xì)胞株驗證 1,、測序驗證 提取陽性單克隆細(xì)胞株的基因組,，將靶標(biāo)基因酶切克隆至T載體后測序，以確定是否敲除成功,。 實驗結(jié)果示例： 該基因有兩個單克隆細(xì)胞株,，A1和A2。 單克隆細(xì)胞A1的目的基因在sgRNA2位置出現(xiàn)兩種突變形式,，分別缺失1個和19個堿基,，在新序列的第337位和第355位堿基提前出現(xiàn)終止密碼子。 單克隆細(xì)胞A2的目的基因在sgRNA2位置發(fā)生突變,，插入1個堿基,，在新序列的第340位堿基提前出現(xiàn)終止密碼子。
產(chǎn)品規(guī)格：T25培養(yǎng)瓶/凍存管 細(xì)胞數(shù)量1x10^6
運輸方式：常溫運輸/干冰運輸 用途限制：僅供科研
細(xì)胞接收后處理： 收到細(xì)胞后,，及時核對培養(yǎng)瓶/凍存管上標(biāo)注的細(xì)胞名稱是否正確,，以及培養(yǎng)瓶是否有破損或漏液等異常情況。如發(fā)現(xiàn)問題請及時與銷售聯(lián)系,。 收到常溫運輸?shù)募?xì)胞培養(yǎng)瓶后,，請在顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，并拍照留證（為細(xì)胞售后提供依據(jù)）,。將培養(yǎng)瓶放置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),，待細(xì)胞融合度為70%~80%狀態(tài)再進行細(xì)胞處理。（注：運輸過程易導(dǎo)致部分細(xì)胞脫落,，漂浮,，屬正常現(xiàn)象,，放置培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),，可使其貼壁；另,。請使用新鮮培養(yǎng)基和新的T53培養(yǎng)瓶進行細(xì)胞傳代，不要使用原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,。 收到凍存細(xì)胞應(yīng)立即復(fù)蘇或放置液氮罐中,。 收到復(fù)蘇好后的細(xì)胞一周內(nèi)，如若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不佳或細(xì)胞污染,，請及時與銷售聯(lián)系,，并提供該細(xì)胞詳細(xì)的實驗操作說明和每天細(xì)胞狀態(tài)的圖片記錄（填寫【細(xì)胞售后反饋表】）,，經(jīng)由我司技術(shù)人員核實，若確認(rèn)細(xì)胞本身存在問題,，由我司重新復(fù)蘇細(xì)胞并補發(fā),。

公司簡介

廣州艾迪基因科技有限責(zé)任公司由多名留學(xué)歸國博士和生物科技領(lǐng)域精英聯(lián)合創(chuàng)建，坐落于廣州產(chǎn)業(yè)示范基地——科學(xué)城,。作為基因編輯/細(xì)胞單克隆專家,，公司專注于發(fā)展和優(yōu)化基于CRISPR/Cas的基因組編輯技術(shù)，依托*單克隆打印平臺,，為用戶提供高質(zhì)量的技術(shù)服務(wù)和基因編輯產(chǎn)品,。
        我們堅守“以客戶為中心、以奮斗者為本”的原則,，秉承“創(chuàng)新,、共享”的發(fā)展理念，以達到客戶對“產(chǎn)品質(zhì)量的滿意,，*技術(shù)的滿意,，售后服務(wù)的滿意 ”為目標(biāo)，確保每一位用戶都能獲得更的體驗,。