前  言

目前已有8款CAR-T藥物相繼獲批上市,，其中6款獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn),，2款獲得中國(guó)NMPA批準(zhǔn)。CAR-T療法在B細(xì)胞白血病或淋巴瘤患者中的治療效果,，改變了抗癌療法,，為難治性患者提供了潛在的治療選擇。但是,，CAR-T療法的一些瓶頸限制其廣泛應(yīng)用,，如毒副作用嚴(yán)重、抗原逃逸,、治療持續(xù)性,、異質(zhì)性等，特別是在實(shí)體瘤中治療效果有限,。因此,，科研人員還在通過(guò)不斷的研究，以使其能夠得到更廣泛的應(yīng)用,。

1 CAR-T療法的局限性

CAR-T療法實(shí)現(xiàn)持久緩解的主要有四種限制：

一,，CAR-T細(xì)胞衰竭。比如有的患者自身T細(xì)胞無(wú)法成功生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞,，或者生成的CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增不充分,。有些患者有限的持久性是疾病復(fù)發(fā)的潛在因素。

第二,，抗原調(diào)節(jié),。如惡性B細(xì)胞上CD19或CD22的丟失或下調(diào)，造成抗原逃逸，對(duì)CAR-T療法產(chǎn)生抗藥性,。

第三,，CAR-T療法毒性，主要是嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性,。關(guān)于CRS的治療是否干預(yù)CAR緩解的持久性影響還在研究中,。

第四，未知的疾病機(jī)制,，這是正在進(jìn)行的研究工作的重點(diǎn),，以優(yōu)化CAR-T細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用。

CAR-T治療持久性的限制因素[1]

2 CAR設(shè)計(jì)的優(yōu)化

CAR主要由組成部分：抗原結(jié)合域,、鉸鏈,、跨膜域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域。每部分有不同的功能,，組成部件的多樣化組合,，可以實(shí)現(xiàn)CAR分子的優(yōu)化設(shè)計(jì)?？乖Y(jié)合域常為單鏈抗體（scFv),，負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合靶抗原。鉸鏈和跨膜域可將scFv錨定于細(xì)胞膜上,。胞內(nèi)信號(hào)域由共刺激因子和CD3信號(hào)域組成,。當(dāng)抗原被識(shí)別和結(jié)合后，產(chǎn)生刺激信號(hào)傳至胞內(nèi)信號(hào)域,，T細(xì)胞被激活并發(fā)揮效應(yīng)功能,。

CAR分子結(jié)構(gòu)[2]

scFv序列通常來(lái)源于鼠或人的單克隆抗體。scFv可對(duì)CAR功能產(chǎn)生影響,，影響CAR對(duì)靶抗原的特異性和親和力,。

鉸鏈區(qū)提供足夠的靈活性來(lái)克服空間位阻，影響抗原結(jié)合和CAR信號(hào),。來(lái)自CD8,、CD28、IgG1或IgG4的氨基酸序列已被用于CAR鉸鏈結(jié)構(gòu)域,?？缒そY(jié)構(gòu)域?qū)AR錨定在T細(xì)胞膜上，通常來(lái)源于I型蛋白,，如CD3ζ,、CD28、CD4或CD8α,，影響CAR的穩(wěn)定性和功能,。

胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域通常包括激活區(qū)、一個(gè)或多個(gè)共刺激域。絕大多數(shù)CAR通過(guò)CD3ζ衍生的相關(guān)的免疫受體激活CAR-T細(xì)胞,。共刺激信號(hào)對(duì)獲得更佳功能及持久性的T細(xì)胞是必要的,，研究廣泛的共刺激結(jié)構(gòu)域來(lái)自CD28或4-1BB（CD137）。

有研究人員設(shè)計(jì)了一種可互換靶點(diǎn)的通用CAR分子：Supra CAR,，由T細(xì)胞上表達(dá)的通用受體（zipCAR）和腫瘤靶向單鏈抗體適配器（zipFv）組成,。zipFv的單鏈抗體與腫瘤抗原結(jié)合，通過(guò)亮氨酸拉鏈激活T細(xì)胞上的zipCAR,。具有多種特征有助于對(duì)抗復(fù)發(fā),、緩解過(guò)度激活和增強(qiáng)特異性。

可互換靶點(diǎn)的通用CAR分子[3]

3更多解決方案

對(duì)于CAR-T治療過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞因子風(fēng)暴和神經(jīng)毒性,，主要是干預(yù)細(xì)胞因子的分泌或控制T細(xì)胞的過(guò)度激活,，如通過(guò)抗體阻斷IL-1、IL-6和GM-CSF,，進(jìn)而阻斷過(guò)度的炎癥反應(yīng),。面對(duì)治療過(guò)程中產(chǎn)生抗性的問(wèn)題，可以通過(guò)設(shè)計(jì)多靶向的CAR分子或增加靶抗原的表達(dá)來(lái)改善,，或是提高scFv與靶抗原的親和力,，也可能有助于CAR-T細(xì)胞識(shí)別低密度的靶抗原。

目前CAR-T的制造多使用患者的異質(zhì)性T細(xì)胞,。某些特定T細(xì)胞亞群修飾的CAR-T細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生更好的效果。制造通用型細(xì)胞是未來(lái)發(fā)展的方向,。有一種形式是抗體帶上生物素等標(biāo)簽,，與抗原結(jié)合后標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，然后針對(duì)這個(gè)標(biāo)簽開(kāi)發(fā)的 CAR-T 細(xì)胞就會(huì)被激活,，發(fā)揮細(xì)胞殺傷功能,。

CAR-T細(xì)胞研究試驗(yàn)圍繞療效、毒性和耐藥性展開(kāi),，以尋找新型靶點(diǎn),、闡明信號(hào)機(jī)制為基礎(chǔ)，結(jié)合新型技術(shù)的應(yīng)用,，通過(guò)CAR設(shè)計(jì),、轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和細(xì)胞類型的不斷研究，必將提高CAR-T治療效果,，并適用于更多類型癌癥患者的治療,。

義翹神州CAR-T開(kāi)發(fā)解決方案

作為一家專注于為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供關(guān)鍵試劑和技術(shù)服務(wù)的企業(yè)，義翹神州特地推出了綜合性的CAR-T細(xì)胞療法開(kāi)發(fā)解決方案,，支持客戶更方便,、更快速地完成從早期靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)到臨床前研究的每一個(gè)階段。

CAR 開(kāi)發(fā)

scFv候選分子開(kāi)發(fā)：scFv抗體庫(kù)構(gòu)建平臺(tái)、Beacon®單B細(xì)胞發(fā)現(xiàn)平臺(tái),、流式單B細(xì)胞發(fā)現(xiàn)平臺(tái),、雜交瘤開(kāi)發(fā)平臺(tái)

scFv候選分子篩選：scFv抗體親和力檢測(cè) （SPR/BLI）、檢測(cè)用過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建

靶點(diǎn)蛋白：250+ CAR-T熱門(mén)靶點(diǎn)蛋白,，涵蓋熒光標(biāo)記,、生物素標(biāo)記和無(wú)標(biāo)記形式，高活性,，高批間一致性,，更接近于天然蛋白結(jié)構(gòu)。

蛋白表達(dá)：哺乳動(dòng)物瞬時(shí)表達(dá),、桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá),、大腸桿菌蛋白表達(dá)、無(wú)細(xì)胞表達(dá)

T 細(xì)胞激活

CD3單克隆抗體：GMP-10977-H001

Effect of human CD3 (humanized OKT3) antibody on the proliferation and IFN-gamma secretion of CD4+ T cells.

CD28單克隆抗體：GMP-11524-H001

Effect of human CD28 antibody on stimulating IL-2 secretion of CD4+ T cells co-activated with CD3 antibody.

慢病毒包裝

無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基及補(bǔ)料液

SMM 293-CD1 培養(yǎng)基（貨號(hào)：M293CD1）

相同條件下,，使用SMM 293-CD1培養(yǎng)基,，HEK293F細(xì)胞密度更好。

多款現(xiàn)貨無(wú)血清,、無(wú)動(dòng)物源的HEK293培養(yǎng)基

細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑

義翹神州擁有高品質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑 Sinofection® Transfection Reagent（Cat#: STF02）,，細(xì)胞毒性小、重復(fù)性高,，可用于慢病毒載體的高效轉(zhuǎn)染,，轉(zhuǎn)染效率基本可以達(dá)到95%以上。

GMP級(jí)核酸酶

義翹神州提供GMP級(jí)條件下生產(chǎn)的全-能核酸酶Super Nuclease（Cat#: GMP-SSNP01）,，無(wú)動(dòng)物源性,，可高效降解單鏈、雙鏈,、線性,、環(huán)狀、超螺旋等任何形式的DNA及RNA,。超高活性,，應(yīng)用場(chǎng)景廣泛且使用量低不易殘留，質(zhì)量,、性能,、供貨能力可靠,，并已完成在FDA的藥物主文件申報(bào)備案（DMF Number#:35978），滿足藥物申報(bào)的需求,。

相同條件下,，不同用量的GMP級(jí)全-能核酸酶和其他品牌核酸酶對(duì)鮭魚(yú)精DNA的降解效率相當(dāng)

細(xì)胞庫(kù)檢測(cè)

義翹神州遵循NMPA、FDA,、EMA,、ICH等多個(gè)國(guó)內(nèi)外法規(guī)和指導(dǎo)原則，建立了全面的細(xì)胞庫(kù)測(cè)定方法,，助力于CAR-T細(xì)胞治療的安全性,，主要包括以下幾個(gè)檢測(cè)方面：無(wú)菌檢查、支原體檢查,、內(nèi)外源病毒污染檢查,、成瘤性檢查等。

慢病毒包裝質(zhì)粒生產(chǎn)

義翹神州升級(jí)改造后的慢病毒質(zhì)粒制備平臺(tái),，采用GMP級(jí)別的生產(chǎn)線,，對(duì)過(guò)程和最終產(chǎn)品的嚴(yán)格管控，確保了最終產(chǎn)品質(zhì)量符合客戶需求,。義翹神州可以提供從μg級(jí)別,，mg級(jí)別至g級(jí)別不同規(guī)模的科研級(jí)質(zhì)粒生產(chǎn)服務(wù)，滿足不同的需求,。

CAR-T 細(xì)胞擴(kuò)增

更規(guī)范的GMP級(jí)質(zhì)量管理體系,、文件齊全的質(zhì)量保證管理體系、更穩(wěn)定質(zhì)量控制體系,、更安全的產(chǎn)品安全性檢測(cè)體系：四大體系造就高品質(zhì)GMP級(jí)細(xì)胞因子,，保障CAR-T開(kāi)發(fā)！

以GMP-IL21產(chǎn)品為例

高純度：SDS-PAGE和SEC-HPLC高于95%

高批間一致性

高穩(wěn)定性

CAR-T細(xì)胞質(zhì)量控制

CAR-T細(xì)胞純度檢測(cè)

CAR-T細(xì)胞活性及功能性檢測(cè)

ELISA檢測(cè)試劑盒

過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)

CAR-T細(xì)胞安全性檢測(cè)

無(wú)菌檢查

支原體檢查

細(xì)胞內(nèi)源病毒因子檢查

外源病毒因子檢查

【參考資料】

[1] Nirali and T erry,  Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nature reviews | Clinical Oncology

[2] Sarwish, et al.  Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nature reviews | Clinical Oncology

[3] Rebecca and  Marcela, Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells. Nature reviews | Cancer