前  言

目前已有8款CAR-T藥物相繼獲批上市,，其中6款獲得美國FDA批準，2款獲得中國NMPA批準,。CAR-T療法在B細胞白血病或淋巴瘤患者中的治療效果,，改變了抗癌療法，為難治性患者提供了潛在的治療選擇,。但是,，CAR-T療法的一些瓶頸限制其廣泛應(yīng)用,，如毒副作用嚴重、抗原逃逸,、治療持續(xù)性、異質(zhì)性等,，特別是在實體瘤中治療效果有限,。因此，科研人員還在通過不斷的研究,，以使其能夠得到更廣泛的應(yīng)用,。

1 CAR-T療法的局限性

CAR-T療法實現(xiàn)持久緩解的主要有四種限制：

一，CAR-T細胞衰竭,。比如有的患者自身T細胞無法成功生產(chǎn)CAR-T細胞,，或者生成的CAR-T細胞擴增不充分。有些患者有限的持久性是疾病復(fù)發(fā)的潛在因素,。

第二,，抗原調(diào)節(jié)。如惡性B細胞上CD19或CD22的丟失或下調(diào),，造成抗原逃逸,，對CAR-T療法產(chǎn)生抗藥性。

第三,，CAR-T療法毒性,，主要是嚴重的細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性。關(guān)于CRS的治療是否干預(yù)CAR緩解的持久性影響還在研究中,。

第四,，未知的疾病機制，這是正在進行的研究工作的重點,，以優(yōu)化CAR-T細胞療法的臨床應(yīng)用,。

CAR-T治療持久性的限制因素[1]

2 CAR設(shè)計的優(yōu)化

CAR主要由組成部分：抗原結(jié)合域、鉸鏈,、跨膜域和細胞內(nèi)信號域,。每部分有不同的功能，組成部件的多樣化組合,，可以實現(xiàn)CAR分子的優(yōu)化設(shè)計,。抗原結(jié)合域常為單鏈抗體（scFv),，負責識別并結(jié)合靶抗原,。鉸鏈和跨膜域可將scFv錨定于細胞膜上。胞內(nèi)信號域由共刺激因子和CD3信號域組成,。當抗原被識別和結(jié)合后,，產(chǎn)生刺激信號傳至胞內(nèi)信號域,，T細胞被激活并發(fā)揮效應(yīng)功能。

CAR分子結(jié)構(gòu)[2]

scFv序列通常來源于鼠或人的單克隆抗體,。scFv可對CAR功能產(chǎn)生影響,，影響CAR對靶抗原的特異性和親和力。

鉸鏈區(qū)提供足夠的靈活性來克服空間位阻,，影響抗原結(jié)合和CAR信號,。來自CD8、CD28,、IgG1或IgG4的氨基酸序列已被用于CAR鉸鏈結(jié)構(gòu)域,。跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)AR錨定在T細胞膜上,，通常來源于I型蛋白,，如CD3ζ、CD28,、CD4或CD8α,，影響CAR的穩(wěn)定性和功能。

胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域通常包括激活區(qū),、一個或多個共刺激域,。絕大多數(shù)CAR通過CD3ζ衍生的相關(guān)的免疫受體激活CAR-T細胞。共刺激信號對獲得更佳功能及持久性的T細胞是必要的,，研究廣泛的共刺激結(jié)構(gòu)域來自CD28或4-1BB（CD137）,。

有研究人員設(shè)計了一種可互換靶點的通用CAR分子：Supra CAR,，由T細胞上表達的通用受體（zipCAR）和腫瘤靶向單鏈抗體適配器（zipFv）組成,。zipFv的單鏈抗體與腫瘤抗原結(jié)合，通過亮氨酸拉鏈激活T細胞上的zipCAR,。具有多種特征有助于對抗復(fù)發(fā),、緩解過度激活和增強特異性。

可互換靶點的通用CAR分子[3]

3更多解決方案

對于CAR-T治療過程中出現(xiàn)的細胞因子風暴和神經(jīng)毒性,，主要是干預(yù)細胞因子的分泌或控制T細胞的過度激活,，如通過抗體阻斷IL-1、IL-6和GM-CSF,，進而阻斷過度的炎癥反應(yīng),。面對治療過程中產(chǎn)生抗性的問題，可以通過設(shè)計多靶向的CAR分子或增加靶抗原的表達來改善,，或是提高scFv與靶抗原的親和力,，也可能有助于CAR-T細胞識別低密度的靶抗原。

目前CAR-T的制造多使用患者的異質(zhì)性T細胞,。某些特定T細胞亞群修飾的CAR-T細胞可能會產(chǎn)生更好的效果,。制造通用型細胞是未來發(fā)展的方向,。有一種形式是抗體帶上生物素等標簽，與抗原結(jié)合后標記腫瘤細胞,，然后針對這個標簽開發(fā)的 CAR-T 細胞就會被激活,，發(fā)揮細胞殺傷功能。

CAR-T細胞研究試驗圍繞療效,、毒性和耐藥性展開,，以尋找新型靶點、闡明信號機制為基礎(chǔ),，結(jié)合新型技術(shù)的應(yīng)用,，通過CAR設(shè)計、轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和細胞類型的不斷研究,，必將提高CAR-T治療效果,，并適用于更多類型癌癥患者的治療。

義翹神州CAR-T開發(fā)解決方案

作為一家專注于為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供關(guān)鍵試劑和技術(shù)服務(wù)的企業(yè),，義翹神州特地推出了綜合性的CAR-T細胞療法開發(fā)解決方案,，支持客戶更方便、更快速地完成從早期靶點發(fā)現(xiàn)到臨床前研究的每一個階段,。

CAR 開發(fā)

scFv候選分子開發(fā)：scFv抗體庫構(gòu)建平臺,、Beacon®單B細胞發(fā)現(xiàn)平臺、流式單B細胞發(fā)現(xiàn)平臺,、雜交瘤開發(fā)平臺

scFv候選分子篩選：scFv抗體親和力檢測 （SPR/BLI）,、檢測用過表達細胞株構(gòu)建

靶點蛋白：250+ CAR-T熱門靶點蛋白，涵蓋熒光標記,、生物素標記和無標記形式,，高活性，高批間一致性,，更接近于天然蛋白結(jié)構(gòu),。

蛋白表達：哺乳動物瞬時表達、桿狀病毒-昆蟲表達,、大腸桿菌蛋白表達,、無細胞表達

T 細胞激活

CD3單克隆抗體：GMP-10977-H001

Effect of human CD3 (humanized OKT3) antibody on the proliferation and IFN-gamma secretion of CD4+ T cells.

CD28單克隆抗體：GMP-11524-H001

Effect of human CD28 antibody on stimulating IL-2 secretion of CD4+ T cells co-activated with CD3 antibody.

慢病毒包裝

無血清細胞培養(yǎng)基及補料液

SMM 293-CD1 培養(yǎng)基（貨號：M293CD1）

相同條件下，使用SMM 293-CD1培養(yǎng)基,，HEK293F細胞密度更好,。

多款現(xiàn)貨無血清、無動物源的HEK293培養(yǎng)基

細胞轉(zhuǎn)染試劑

義翹神州擁有高品質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑 Sinofection® Transfection Reagent（Cat#: STF02），細胞毒性小,、重復(fù)性高,，可用于慢病毒載體的高效轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率基本可以達到95%以上,。

GMP級核酸酶

義翹神州提供GMP級條件下生產(chǎn)的全-能核酸酶Super Nuclease（Cat#: GMP-SSNP01）,，無動物源性，可高效降解單鏈,、雙鏈,、線性、環(huán)狀,、超螺旋等任何形式的DNA及RNA,。超高活性，應(yīng)用場景廣泛且使用量低不易殘留,，質(zhì)量,、性能、供貨能力可靠,，并已完成在FDA的藥物主文件申報備案（DMF Number#:35978）,，滿足藥物申報的需求。

相同條件下,，不同用量的GMP級全-能核酸酶和其他品牌核酸酶對鮭魚精DNA的降解效率相當

細胞庫檢測

義翹神州遵循NMPA,、FDA、EMA,、ICH等多個國內(nèi)外法規(guī)和指導(dǎo)原則,，建立了全面的細胞庫測定方法，助力于CAR-T細胞治療的安全性,，主要包括以下幾個檢測方面：無菌檢查,、支原體檢查、內(nèi)外源病毒污染檢查,、成瘤性檢查等。

慢病毒包裝質(zhì)粒生產(chǎn)

義翹神州升級改造后的慢病毒質(zhì)粒制備平臺,，采用GMP級別的生產(chǎn)線,，對過程和最終產(chǎn)品的嚴格管控，確保了最終產(chǎn)品質(zhì)量符合客戶需求,。義翹神州可以提供從μg級別,，mg級別至g級別不同規(guī)模的科研級質(zhì)粒生產(chǎn)服務(wù)，滿足不同的需求,。

CAR-T 細胞擴增

更規(guī)范的GMP級質(zhì)量管理體系,、文件齊全的質(zhì)量保證管理體系,、更穩(wěn)定質(zhì)量控制體系、更安全的產(chǎn)品安全性檢測體系：四大體系造就高品質(zhì)GMP級細胞因子,，保障CAR-T開發(fā),！

以GMP-IL21產(chǎn)品為例

高純度：SDS-PAGE和SEC-HPLC高于95%

高批間一致性

高穩(wěn)定性

CAR-T細胞質(zhì)量控制

CAR-T細胞純度檢測

CAR-T細胞活性及功能性檢測

ELISA檢測試劑盒

過表達細胞株構(gòu)建服務(wù)

CAR-T細胞安全性檢測

無菌檢查

支原體檢查

細胞內(nèi)源病毒因子檢查

外源病毒因子檢查

【參考資料】

[1] Nirali and T erry,  Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nature reviews | Clinical Oncology

[2] Sarwish, et al.  Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nature reviews | Clinical Oncology

[3] Rebecca and  Marcela, Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells. Nature reviews | Cancer