增強(qiáng)型 ECL超敏發(fā)光液產(chǎn)品介紹：

ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒能夠被辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化發(fā)光。本試劑盒優(yōu)化了底物組成,，使用了新型高效增強(qiáng)劑,，發(fā)光強(qiáng)度比傳統(tǒng) ECL顯色液提高了30-100倍，并有效地降低了背景,。試劑盒使用新的氧化劑代替不穩(wěn)定的雙氧水,，提高了試劑盒的穩(wěn)定性，室溫可穩(wěn)定放置1年,。工作液被 HRP 催化后,，發(fā)出特定波長(zhǎng)熒光（400-450 nm），可對(duì)X光膠片曝光,，也可直接使用熒光CCD掃描,，主要應(yīng)用于Western 檢測(cè)以及化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng),。

使用說(shuō)明：

一、緩沖液的配置：

1,、一抗工作濃度：0.2-1.0 µg/mL,。

2、HRP 標(biāo)記二抗工作濃度：10-500 ng/mL,，根據(jù)二抗效價(jià)調(diào)整,。

3、顯色液的使用比例：A液: B液 = 1:1（現(xiàn)用現(xiàn)配）,；10 cm2轉(zhuǎn)印膜使用1-2 mL工作液,。

二、增強(qiáng)型 ECL超敏發(fā)光液操作步驟：

1,、根據(jù)常規(guī)操作轉(zhuǎn)印結(jié)束后,，進(jìn)行封閉、一抗孵育,、二抗孵育以及必要的洗膜步驟,，根據(jù)膜的大小，按每 250px2膜使用1-2mL工作液,，按比例吸取等體積溶液A和溶液B混勻,，配制成發(fā)光檢測(cè)工作液。

2,、用平頭鑷子將膜取出,，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體,。用移液器將工作液加到轉(zhuǎn)印膜上,，使其均勻覆蓋，室溫孵育 1-2 分鐘,，此步驟可在潔凈保鮮膜上或塑料盒中完成,。

3、X 光膠片法

a)用平頭鑷子夾起轉(zhuǎn)印膜,，膜的下緣輕輕接觸吸水紙,，去除膜上多余的液體，留下少量工作液,，不要讓膜全干燥,。膜的蛋白面朝上，包裹于潔凈保鮮膜內(nèi),。輕輕趕出其間的氣泡用小塊透明膠帶粘住四角,，固定在 X 光片暗盒內(nèi)。

b)在暗室中取一張X光膠片置于包裹的膜上,，合上暗盒,，曝光30秒至1分鐘,。立即顯影、定影,，根據(jù)曝光強(qiáng)度,，調(diào)整下一張X光膠片的曝光時(shí)間。如果背景過(guò)高,，可以使用兩張X光膠片同時(shí)壓片。

4,、熒光拍照法：

a)如果需要使用 CCD 拍照,，可以將膜放置于工作液中，開(kāi)機(jī)后按照使用說(shuō)明,，將轉(zhuǎn)印膜取出,，進(jìn)行拍照。

b)可以根據(jù)背景情況,，調(diào)整機(jī)器測(cè)量參數(shù),，提高信噪比。

5,、管式化學(xué)發(fā)光法：

a)將ECL的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)波長(zhǎng)可設(shè)定在 425nm 左右,，可以選擇單點(diǎn)測(cè)量，或者取多次平均值,。

b)按照機(jī)器要求,，將配制好的工作液加入到樣品管中，間隔一定時(shí)間測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度,。

c)意ECL系統(tǒng)的發(fā)光到達(dá)峰值有一定延遲（30-300 秒）,，不同樣本的測(cè)量時(shí)間間隔要固定。

d)HRP 催化ECL發(fā)光的體系還受到反應(yīng)溫度以及 pH 的強(qiáng)烈影響,，所以工作試劑準(zhǔn)備以及發(fā)光測(cè)量需要考慮到此類因素,。

注意事項(xiàng)：

1、試劑盒溶液A為底物,，保存于避光試劑瓶中,，溶液B為氧化劑。通常取樣順序是先取底物 溶液A,，換槍頭后再取氧化劑溶液B,。

2、本試劑盒較為穩(wěn)定,，室溫（25℃）可以保存一年以上,，長(zhǎng)期不用建議保存在 2-8℃。

3,、使用生物素-親和素系統(tǒng)時(shí),，避免使用牛奶封閉,，可能會(huì)造成背景過(guò)高。

4,、金屬氧化物顆?？赡軙?huì)造成膜上出現(xiàn)顆粒狀斑點(diǎn)，避免使用帶有銹跡的剪刀以及鑷子,，可以使用平頭塑料鑷子,。

5、sodium azide抑制 HRP 的催化能力,，在緩沖液中盡量避免使用sodium azide作為防腐劑,。

6、封閉,、洗膜,、孵育等步驟耗時(shí)較長(zhǎng)，注意膜與塑料界面的摩擦不均勻可能造成部分位置條帶消失,，可以在保鮮膜中孵育以及封閉,，洗膜的塑料盒底面不要有明顯凸起，可以通過(guò)剪角的方法,，區(qū)別轉(zhuǎn)印膜有蛋白的一面,。

7、不同轉(zhuǎn)印膜對(duì)蛋白的吸附能力不同,，硝酸纖維素較軟,，避免出現(xiàn)折痕。PVDF膜使用前需要使用甲醇水化均勻,。

8,、勿將多張膜置于同一個(gè)洗膜盒中洗膜，相互吸附以及摩擦可能造成很深的背景,。

9,、轉(zhuǎn)印、封閉,、孵育都要避免氣泡,。

A and Q

Q：膠片無(wú)條帶顯現(xiàn)或者信號(hào)較弱。

A1：轉(zhuǎn)膜的效率低 --用預(yù)染色分子量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷,，提高轉(zhuǎn)膜效率,。

A2：抗原/抗體量少或不匹配 --增加抗原/抗體量或選擇合適抗原/抗體。

A3：X光膠片有問(wèn)題 --X光片洗片以后應(yīng)當(dāng)為透明的膠片,，如果全黑則說(shuō)明已經(jīng)全曝光了,，應(yīng)當(dāng)廢棄。

A4：定顯影液有問(wèn)題 --可以先曝光一張膠片來(lái)驗(yàn)證，若有問(wèn)題及時(shí)更換新的定顯影液,。

A5：反應(yīng)系統(tǒng)中HRP量過(guò)多 --稀釋HRP標(biāo)記物,。

Q：X光膠片背景臟。

A1：一抗,、二抗?jié)舛忍?--降低抗體濃度,，延長(zhǎng)封閉時(shí)間。

A2：抗體未清洗干凈 --增加洗膜次數(shù),。

Q：條帶有空斑,。

A：抗原以及二抗的濃度過(guò)高 --稀釋樣品重新跑膠，也可以將混合好的顯色液冰浴后,，加入到膜上,，立即快速顯色。

Q：帶型不規(guī)則,。

A：轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡也有可能是轉(zhuǎn)印膜沒(méi)有水化均勻 --轉(zhuǎn)膜時(shí)盡量?jī)?yōu)化條件。