細菌轉(zhuǎn)座子突變體文庫構(gòu)建介紹

轉(zhuǎn)座子(transposon)是一類可以自主位移并插入宿主基因組中隨機位點的移動遺傳因子,，這種轉(zhuǎn)位特性使它可以直接或間接地造成基因重排，引起基因變異,。

隨著許多微生物基因組全序列的獲得,人們對微生物關注和研究的熱點已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組學轉(zhuǎn)移到功能基因組學,，在大量的分子遺傳研究方法中，轉(zhuǎn)座子隨機誘變技術因操作簡便易行而備受關注。

該方法是將轉(zhuǎn)座子引入細菌染色體中,，隨機插入誘變某些基因得到大量的突變株,從中篩選感興趣表型的突變株,，進而研究與該表型相關的被失活基因的功能。現(xiàn)在轉(zhuǎn)座子突變技術已經(jīng)成為微生物分子遺傳學研究的有力工具之一,，轉(zhuǎn)座子及其衍生物作為插入突變原或分子標簽已被廣泛地應用于基因的分離和克隆當中,特別是某些具有隨機轉(zhuǎn)座特性的轉(zhuǎn)座子,已成為發(fā)現(xiàn)新基因,、克隆功能基因、發(fā)掘己知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具,。

構(gòu)建細菌的轉(zhuǎn)座子隨機突變庫是從基因組水平篩選毒力相關基因,、生物被膜相關基因等與特定表型相關基因的一種重要手段。我們做過銅單胞菌,、大腸桿菌,、肺炎克雷伯桿菌、幽門螺旋桿菌,、金色葡萄球菌,、枯草芽孢桿菌、變形鏈球菌,、糞腸球菌,、肺炎鏈球菌等細菌的轉(zhuǎn)座子突變體構(gòu)建，具有豐富的構(gòu)建經(jīng)驗,，下面給大家簡單介紹一下我們做過的轉(zhuǎn)座子突變體文庫構(gòu)建大概過程,，供相關科研工作者參考。

1.    菌株選擇

一般可以做標準菌株也可以做自己篩選分離的特殊菌株,。主要還是看我們想研究的客戶目的。比如我們在土壤中或者血液中分離出來一種抗性非常強的菌株,，那么我們也是可以對此菌株進行突變體文庫構(gòu)建,，進一步去篩選相關耐藥基因和耐藥機制的。由于構(gòu)建出來的突變體庫數(shù)量多,，因此此文庫比較適合專門針對某種細菌研究的實驗室進行構(gòu)建研究,。

2.    提前準備：

（1）菌株全基因組測序數(shù)據(jù)：為后續(xù)突變株插入位點驗證分析提供數(shù)據(jù)參考；

（2）抗性分析：確定對哪些抗生素敏感,，從而為載體構(gòu)建時的抗生素選擇提供參考,。

3.    載體選擇和構(gòu)建

Tn917、Tn10 及 mariner 類家族轉(zhuǎn)座元件是目前在芽孢桿菌中應用比較廣泛的 3 類轉(zhuǎn)座子,，而且都已被改造并成功應用于變體庫的構(gòu)建及基因功能的研究中,，特別是芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)座頻率高，但各具有不同的轉(zhuǎn)座特點,，其中 mariner 類家族轉(zhuǎn)座元件更具優(yōu)勢,，表現(xiàn)出良好的應用前景。

轉(zhuǎn)座子 Tn917 是一種鏈球菌 Tn3 類似轉(zhuǎn)座子，被構(gòu)建于溫敏復制質(zhì)粒載體如 pTV1[1]（圖1）【5】,、pTV1Ts及具有葡萄球菌復制子 pE194,、pE194Ts 的衍生質(zhì)粒上[8]。Tn917 長度為 5.4 kb,，攜帶可誘導的紅霉抗性基因,，含有與 Tn3 家族轉(zhuǎn)座子類似的末端重復序列，并且 Tn917 的轉(zhuǎn)座酶與 Tn3 的轉(zhuǎn)座酶有 80%的相似性,。

轉(zhuǎn)座子 Tn10 是繼轉(zhuǎn)座子 Tn917 之后,，被應用于轉(zhuǎn)座誘變的另一個很好的選擇。Tn10 是一種鼠傷寒沙氏菌 Salmonella typhimurium 轉(zhuǎn)座子,。它是具有多種抗生素抗性標記質(zhì)粒 R100.1 的一個組成部分,，長度為 9300 bp，由兩端長 1329 bp 的末端反向重復序列 IS10 及位于兩端 IS10 之間的長 6700 bp 的四環(huán)素抗性基因組成,。其中,，四環(huán)素抗性基因 tetR 來自一種從噬菌體P22 中獲得的 R 因子。Tn10 可在鼠傷寒沙菌及大腸桿菌染色體上發(fā)生不依賴寄主重組系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座,，并且能夠轉(zhuǎn)座插入到沙氏菌染色體的多個不同位點上,。Mariner 轉(zhuǎn)座元件是一種  簡單的真核轉(zhuǎn)座子，與其他轉(zhuǎn)座子相比,，mariner 轉(zhuǎn)座元件具有插入位點隨機性高,，以及與品種特定的寄主因素無關、可以在不同品種間水平轉(zhuǎn)移的特點Mariner 及其類似轉(zhuǎn)座元件被稱作 MLEs（Mariner-like elements）Mariner 家族轉(zhuǎn)座元件  活躍,、研究  成熟的兩種轉(zhuǎn)座元件是 Himar1 和 Mos1 轉(zhuǎn)座元件,。Himar1 轉(zhuǎn)座元件是從西方角蠅中分離得到的[4]，是在細菌誘變中應用  廣泛的 mariner 家族轉(zhuǎn)座子,。Mos1 轉(zhuǎn)座元件來自黑腹果蠅,，是 mariner 家族在真核生物應用中  高效的轉(zhuǎn)座元件。

4.    轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)化和突變體庫構(gòu)建和表型篩選鑒定

5.    技術應用

轉(zhuǎn)座子及其衍生物作為插入突變工具或分子標簽已被廣泛地應用于基因的分離和克隆之中,，特別是某些具有隨機轉(zhuǎn)座特性的轉(zhuǎn)座子,，已成為發(fā)現(xiàn)新基因、克隆功能基因,、發(fā)掘已知基因的功能以及研究蛋白功能的有效工具,。

6、參考文獻

【1】Rhodes K A ,  Ma M C , María A.Rendón, et al. Neisseria genes required for persistence identified via in vivo screening of a transposon mutant library[J]. PLoS pathogens, 2022, 18(5):e1010497.

【2】Poulsen B E ,  Rui Y ,  Clatworthy A E , et al. Defining the core essential genome of Pseudomonas aeruginosa[J]. Cold Spring Harbor Laboratory, 2018(20).

【3】Rajagopal M ,  Martin M J ,  Santiago M , et al. Multidrug Intrinsic Resistance Factors in Staphylococcus aureus Identified by Profiling Fitness within High-Diversity Transposon Libraries[J]. mBio, 2016, 7(4):e00950-16

【4】Mike L A ,  Stark A J ,  Forsyth V S , et al. A systematic analysis of hypermucoviscosity and capsule reveals distinct and overlapping genes that impact Klebsiella pneumoniae fitness[J]. PLoS Pathogens, 2021, 17(3):e1009376.

【5】馬欣, 高學文. 轉(zhuǎn)座子隨機突變芽孢桿菌的研究進展[J]. 中國生物防治學報, 2015(3):10.