小鼠胰腺星狀細(xì)胞需要準(zhǔn)備好細(xì)胞所要用到的培養(yǎng)基和相關(guān)試劑,，雖然所有的貼壁,，半貼壁或者懸浮細(xì)胞處理方式差不多，但是不同的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問(wèn)題存在,，也會(huì)導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞處理不當(dāng),，  或者環(huán)境的不適應(yīng)而造成細(xì)胞的死亡。
小鼠胰腺星狀細(xì)胞培養(yǎng)物的生理環(huán)境不同時(shí)定義為其物理化學(xué)環(huán)境中,，更好地理解血清的組件,，所必需的增殖的生長(zhǎng)因子的鑒定，并更好地理解細(xì)胞在培養(yǎng)的微環(huán)境（即,，細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用,，氣體的擴(kuò)散，與基質(zhì)相互作用）現(xiàn)在允許在無(wú)血清培養(yǎng)基中某些細(xì)胞系的培養(yǎng),。
小鼠胰腺星狀細(xì)胞培養(yǎng)物的主要優(yōu)點(diǎn)是操縱物理化學(xué)（即,，溫度，pH,，滲透壓，O2和CO2張力）和生理環(huán)境（即,，激素和營(yíng)養(yǎng)物濃度）,，其中所述細(xì)胞繁殖的能力。除溫度,，將培養(yǎng)環(huán)境是由生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行控制,。
小鼠胰腺星狀細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)，只要我們細(xì)心操作，注意細(xì)節(jié),，并不是大家說(shuō)的那樣困難,。對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)和有條件的客戶(hù)，建議由公司代為培養(yǎng)細(xì)胞及進(jìn)行后續(xù)研究,。

細(xì)胞復(fù)蘇技術(shù)：

1. 取出細(xì)胞,，迅速放入37℃溫水中快速解凍

2. 吸出細(xì)胞懸液,并加10倍以上培養(yǎng)液

3. 1000r/分鐘離心5分鐘，去除上清

4. 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶,放入37℃ CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)

5. 鏡檢細(xì)胞貼壁能力,，次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)

培養(yǎng)方法：

收到細(xì)胞后,，在倒置顯微鏡下觀(guān)察整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況：

如果細(xì)胞未長(zhǎng)滿(mǎn)，用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超菌臺(tái)內(nèi),，嚴(yán)格無(wú)菌操作,，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，留10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。

如果細(xì)胞已長(zhǎng)滿(mǎn)（達(dá)80-90%）,。即可進(jìn)行傳代，具體步驟如下：

a,，棄去培養(yǎng)液,，用PBS洗1-2次。

b,，向瓶?jī)?nèi)加入1.0-2.0ml酶液,，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓,，迅速拿回操作臺(tái),，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的培養(yǎng)液,，輕輕吹打細(xì)胞,。

c，加入等量的的培養(yǎng)液,，輕輕吹打混勻后吸出一半,，分到新的培養(yǎng)

d，傳代比例：1:2-1:3

保存和應(yīng)用：

客戶(hù)可以根據(jù)自己的需求選擇新鮮或者凍存的原代細(xì)胞,，如是新鮮原代細(xì)胞,，客戶(hù)收到細(xì)胞后應(yīng)立即將其放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置后2-3h，再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作,。如是凍存細(xì)胞,，客戶(hù)收到細(xì)胞后應(yīng)立即將其放入液氮、-80℃冰箱或立即進(jìn)行復(fù)蘇,。

細(xì)胞復(fù)蘇的原則：

在實(shí)際操作中,，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇,，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法,。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化,，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞,。

1）該細(xì)胞只能用于科研,，不得用于臨床。

2）收到細(xì)胞后首先觀(guān)察細(xì)胞瓶是否完好,，培養(yǎng)液是否有漏液,、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系,。

3）仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū),，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài),、所用培養(yǎng)基,、血清比例、所需細(xì)胞因子等,。

4）用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面,，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問(wèn)題貼壁細(xì)胞會(huì)有少量從瓶壁脫落,，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)過(guò)夜,，隔天再取出觀(guān)察。此時(shí)多數(shù)細(xì)胞均會(huì)貼壁,，若細(xì)胞仍不能貼壁請(qǐng)用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活力,，如果證實(shí)細(xì)胞活力正常，請(qǐng)將細(xì)胞離心后用新鮮培養(yǎng)基再次貼壁培養(yǎng),；如果染色結(jié)果顯示細(xì)胞無(wú)活力,，請(qǐng)拍下照片及時(shí)和我們聯(lián)系，信息確認(rèn)后我們?yōu)槟倜赓M(fèi)寄送一次,。

5）請(qǐng)客戶(hù)用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng),。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)多余的培養(yǎng)基可收集備用，細(xì)胞傳代時(shí)可以一定比例和客戶(hù)自備的培養(yǎng)基混合,，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件;建議直接購(gòu)買(mǎi)我司提供的培養(yǎng)基,。

6）建議客戶(hù)收到細(xì)胞后qian3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài),，便于和我司技術(shù)部溝通交流,。

細(xì)胞培養(yǎng)操作

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中,，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

a,、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

b、加1 mL消化液培養(yǎng)瓶中,，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞,，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 min（視細(xì)胞情況而定），然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml培養(yǎng)基終止消化,。輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中,，1000 rpm離心5 min，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻,。

c、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。下面 T25 瓶為例,；

a、收集細(xì)胞,，裝入無(wú)菌離心管中,，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液,，用PBS清洗一遍,，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。

b,、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液,，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻,，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液,，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c,、將凍存管放入-80℃冰箱,，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

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