小鼠肺大靜脈內皮細胞需要準備好細胞所要用到的培養(yǎng)基和相關試劑,，雖然所有的貼壁，半貼壁或者懸浮細胞處理方式差不多,，但是不同的實驗室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在,，也會導致對細胞處理不當，  或者環(huán)境的不適應而造成細胞的死亡,。
小鼠肺大靜脈內皮細胞培養(yǎng)物的生理環(huán)境不同時定義為其物理化學環(huán)境中,，更好地理解血清的組件，所必需的增殖的生長因子的鑒定,，并更好地理解細胞在培養(yǎng)的微環(huán)境（即,，細胞 - 細胞相互作用，氣體的擴散,，與基質相互作用）現(xiàn)在允許在無血清培養(yǎng)基中某些細胞系的培養(yǎng),。
小鼠肺大靜脈內皮細胞培養(yǎng)物的主要優(yōu)點是操縱物理化學（即，溫度,，pH,，滲透壓,，O2和CO2張力）和生理環(huán)境（即,，激素和營養(yǎng)物濃度），其中所述細胞繁殖的能力,。除溫度,，將培養(yǎng)環(huán)境是由生長培養(yǎng)基進行控制。
小鼠肺大靜脈內皮細胞對于培養(yǎng),，只要我們細心操作,，注意細節(jié)，并不是大家說的那樣困難,。對于有經驗和有條件的客戶,，建議由公司代為培養(yǎng)細胞及進行后續(xù)研究。

細胞復蘇技術：

1. 取出細胞,，迅速放入37℃溫水中快速解凍

2. 吸出細胞懸液,并加10倍以上培養(yǎng)液

3. 1000r/分鐘離心5分鐘,，去除上清

4. 用培養(yǎng)液適當稀釋后接種培養(yǎng)瓶,放入37℃ CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)

5. 鏡檢細胞貼壁能力，次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)

培養(yǎng)方法：

收到細胞后，在倒置顯微鏡下觀察整個細胞生長情況：

如果細胞未長滿,，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內,，嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶,，留10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。

如果細胞已長滿（達80-90%）。即可進行傳代,，具體步驟如下：

a,，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2次,。

b,，向瓶內加入1.0-2.0ml酶液，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓,，迅速拿回操作臺，吸取酶,，加含有6ml 含10%血清的培養(yǎng)液,，輕輕吹打細胞。

c,，加入等量的的培養(yǎng)液,，輕輕吹打混勻后吸出一半，分到新的培養(yǎng)

d,，傳代比例：1:2-1:3

保存和應用：

客戶可以根據(jù)自己的需求選擇新鮮或者凍存的原代細胞,，如是新鮮原代細胞，客戶收到細胞后應立即將其放入CO2細胞培養(yǎng)箱內靜置后2-3h,，再進行后續(xù)的實驗操作,。如是凍存細胞，客戶收到細胞后應立即將其放入液氮,、-80℃冰箱或立即進行復蘇,。

細胞復蘇的原則：

在實際操作中，凍存細胞要進行復蘇,，再培養(yǎng)傳代,。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化,，以避免慢速融化水分滲入細胞內,，再次形成胞內結晶損傷細胞。

1）該細胞只能用于科研,，不得用于臨床,。

2）收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好,，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象,，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系,。

3）仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息,，如細胞形態(tài),、所用培養(yǎng)基、血清比例,、所需細胞因子等,。

4）用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài),。因運輸問題貼壁細胞會有少量從瓶壁脫落,，將細胞置于培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)過夜，隔天再取出觀察,。此時多數(shù)細胞均會貼壁,，若細胞仍不能貼壁請用臺盼藍染色測定細胞活力，如果證實細胞活力正常,，請將細胞離心后用新鮮培養(yǎng)基再次貼壁培養(yǎng),；如果染色結果顯示細胞無活力，請拍下照片及時和我們聯(lián)系,，信息確認后我們?yōu)槟倜赓M寄送一次,。

5）請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶內多余的培養(yǎng)基可收集備用,，細胞傳代時可以一定比例和客戶自備的培養(yǎng)基混合,，使細胞逐漸適應培養(yǎng)條件;建議直接購買我司提供的培養(yǎng)基。

6）建議客戶收到細胞后qian3天各拍幾張細胞照片,，記錄細胞狀態(tài),，便于和我司技術部溝通交流。

細胞培養(yǎng)操作

1）復蘇細胞：將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000 rpm條件下離心3 min,，棄去上清液,，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中,，加入約8 mL培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度,。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

a、棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b,、加1 mL消化液培養(yǎng)瓶中,，使消化液浸潤所有細胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 min（視細胞情況而定）,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml培養(yǎng)基終止消化,。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min,，棄去上清液,，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

c,、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時,，可進行細胞凍存,。下面 T25 瓶為例；

a,、收集細胞,，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min,，棄去上清液,，用PBS清洗一遍，棄盡PBS,，進行細胞計數(shù),。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液,，使細胞密度5×106~1×107/mL,，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液,，注意凍存管做好標識,。

c、將凍存管放入-80℃冰箱,，24 h后轉入液氮灌儲存,。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

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